王玉榮，　師文靜，　佟明友*，　毛海龍（.中國石化撫順石油化工研究院，遼寧撫順300；.遼寧石油化工大學(xué)，遼寧撫順300）

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產(chǎn)油微藻的分離篩選與鑒定

王玉榮1，2，師文靜1，佟明友*1，毛海龍2
（1.中國石化撫順石油化工研究院，遼寧撫順113001；2.遼寧石油化工大學(xué)，遼寧撫順113001）

摘要：微藻所含的油脂是制備生物柴油的理想原料。為了篩選具有產(chǎn)油能力的微藻，作者從自然界水體中分離出8株微藻，對他們的生長特性和產(chǎn)油能力進行評價，旨在篩選出生長速度快、生物量高、油脂含量高的優(yōu)良藻種。實驗結(jié)果得到一種油脂產(chǎn)率較高的CC-B3藻株，它的總脂質(zhì)量分數(shù)為36.30%，生物量達到2.43 g/L，油脂產(chǎn)率為62.9 mg/（L·d）。符合優(yōu)良藻種的條件，是一株高效產(chǎn)油微藻。通過18s rDNA鑒定，該藻株為斜生柵藻（Scenedesmus obliquus），構(gòu)建了該藻株的進化樹。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)油微藻；分離純化；篩選；鑒定

生物質(zhì)能源具有綠色和再生性，發(fā)展生物質(zhì)能是解決全球能源危機的最理想途徑之一[1]。為實現(xiàn)經(jīng)濟和環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展，可再生、無污染的生物質(zhì)能源的開發(fā)與利用已成為研究的熱點[2]。由于微藻具有光合作用效率高、生長周期短、生長速度快，大多分布在江海湖泊中，不與農(nóng)作物爭地，可以整年生長的優(yōu)點，是制備生物柴油燃料的理想原料。利用微藻生產(chǎn)生物柴油最初是在20世紀50年代提出的，而自20世紀70年代起，一些國家政府開始資助研究培養(yǎng)微藻生產(chǎn)可再生液體燃料項目[3]。

不同種類微藻產(chǎn)油能力不同，油脂質(zhì)量分數(shù)最低僅為4.5%，僅有少數(shù)微藻油脂質(zhì)量分數(shù)較高[4]，最高可以達到80%[5]。自然界中存在約40 000種微藻，但被人類開發(fā)利用的數(shù)量不多[6]。因此，開發(fā)自然界微藻資源，篩選高產(chǎn)油微藻用來生產(chǎn)生物柴油，是生物能源產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。

產(chǎn)油微藻的篩選過程如圖1[2]所示，根據(jù)其生物量和油脂含量兩個指標分別進行初步篩選、二次篩選，最后得到綜合性能較好的優(yōu)良藻種。微藻培養(yǎng)過程中，生物量的積累和油脂含量是體現(xiàn)產(chǎn)油微藻應(yīng)用價值的兩個重要特征，也是微藻篩選的重要指標[7]。作者利用簡易的通氣培養(yǎng)裝置，以單位體積總脂產(chǎn)率為指標，對8株經(jīng)過初步生長篩選的微藻進行培養(yǎng)，旨在獲得生長速度快、生物量高、油脂含量高的優(yōu)良藻種，為微藻生物柴油研發(fā)提供原料來源。圖1為篩選微藻藻種簡略圖。

圖1　篩選微藻藻種簡略圖Fig. 1 Schematic diagram of screening microalgae species

1　材料與方法

1.1微藻藻種采集

含藻種的水樣采自大慶黑魚湖、綏芬河、長春北湖。采集水樣用采樣瓶裝好，在實驗室進行分離純化。

1.2藻株的分離與純化

采用平板劃線法對水樣中的微藻進行分離、純化。吸取少量稀釋的水樣接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，在適宜的條件下培養(yǎng)2～3周，用接種環(huán)挑出單藻落，在大口三角瓶中純化培養(yǎng)，3～4周后鏡檢，重復(fù)數(shù)次，直到獲得單克隆純的目標藻株。

1.3培養(yǎng)條件

微藻分離純化與篩選評價試驗均采用BG-11培養(yǎng)基，使用內(nèi)徑3.6 cm，高34 cm的柱狀光生物反應(yīng)器（裝液量為200 mL）培養(yǎng)，裝置示意圖見圖2[8]。培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光暗時間比為12∶12，光照強度為200 μmol／（m2·s），持續(xù)通入壓縮空氣（體積分數(shù)1%CO2）。

1.4實驗方法

首先將藻種接入50 mL大口三角瓶中靜置培養(yǎng)7 d，篩選生長快、不貼壁、不結(jié)團的藻種，初選出的藻種移至1 L三角瓶（600 mL藻液）擴大培養(yǎng)，置水平搖床培養(yǎng)3～5 d，收集藻細胞，最后用新鮮培養(yǎng)基在微藻培養(yǎng)裝置中接種。將藻種的初始濃度統(tǒng)一為A689 nm=0.1。培養(yǎng)周期為14 d，每3 d測一次A689 nm值，檢測藻種生長速率，收集第14 d的藻液，10 000 r/min離心5 min收集藻細胞，凍干后分析測定油脂含量。

圖2　微藻培養(yǎng)裝置Fig. 2 Microalgae culture device

1.5優(yōu)良藻種的18S rDNA鑒定

離心收集對數(shù)生長期的藻細胞，CTAB法[9]提取基因組總DNA。PCR擴展其18S rDNA的PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10×PCR緩沖液5 μL，20 mmol/L MgCl23 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，引物（10 μmol/ L）各0.5 μL，5 U/μL Taq Polymerase 0.4 μL，模板DNA 1 μL，用超純水定容至50 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，74℃延伸90 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。用于擴增18SrDNA的引物序列為18S -1：5′-CCAACCTGGTTGATCCTG CCAGTA-3′，18S-2：5′-CCTTGTTAACGACTTCACCTTCCTCT-3′。PCR產(chǎn)物的測序由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.6分析方法

1.6.1藻液細胞密度與A689 nm關(guān)系的測定將藻液稀釋成7種密度梯度，以BG11培養(yǎng)基為空白，利用754-UV分光光度計測其A689 nm，同時應(yīng)用血球計數(shù)板進行顯微鏡計數(shù)（每個藻樣重復(fù)3次取平均值），對A689 nm與相對應(yīng)的細胞個數(shù)進行回歸分析。

1.6.2藻種比生長速率的測定藻種的比生長速率用來評價微藻在一定時期內(nèi)的整體生長情況，計算公式如下：

比生長速率=（lnN2-lnN1）/（T2-T1）

N1為接種時OD值，N2為培養(yǎng)結(jié)束時的OD值，T1和T2分別是培養(yǎng)開始和培養(yǎng)結(jié)束的時間。

1.6.3生物量的測定將培養(yǎng)得到的藻液10 000 r/min離心5 min得到藻泥，-50℃下冷凍干燥至恒重，稱重得到藻細胞干重。單位體積生物量產(chǎn)率公式如下：

單位體積生物量產(chǎn)率（g/L·d）＝（mt-m0）/（t-t0）

式中：mt為收獲時藻的干重（g/L），m0為接種時藻的干重（g/L），t和t0分別是培養(yǎng)開始和培養(yǎng)結(jié)束的時間

1.6.4油脂質(zhì)量分數(shù)測定方法采用乙酸乙酯/正己烷混合溶劑萃取法對藻粉的總脂質(zhì)量分數(shù)進行測定。

1.6.5計算藻細胞的油脂產(chǎn)率油脂產(chǎn)率=（生物量×油脂質(zhì)量分數(shù)/培養(yǎng)天數(shù)）×100%

2　實驗結(jié)果

2.1藻株的分離純化及初步鑒定

從采集的水樣中分離純化出8株藻株，以微藻的顯微照片及其生長特征為依據(jù)，參照《中國淡水藻類——系統(tǒng)、分類及生態(tài)》，將這些微藻初步鑒定為小球藻、柵藻、小環(huán)藻和單針藻。各藻種來源、細胞形態(tài)等見表1，部分藻株形態(tài)見圖3。

表1　藻種來源及特征Table 1 Sources and characteristics of algae species

圖3　部分藻種的顯微鏡照片（×100）Fig. 3 Optical microscope of four algae（×100）

從表1可知，不同微藻種的細胞形態(tài)、培養(yǎng)液顏色、沉降程度都有一定差異，同一藻種在培養(yǎng)前后期的培養(yǎng)液顏色也不一樣。從圖3中可看出，柵藻屬藻種細胞以群體形態(tài)存在，小球藻、小環(huán)藻以單細胞狀態(tài)存在。

2.2藻液細胞密度與A689 nm的相關(guān)性

按照1.6.1的方法，以藻液A689 nm為橫坐標（X），以顯微鏡得到的細胞密度為縱坐標（Y）作圖（見圖4），并回歸分析得回歸方程為：y =（1.705x - 0.262 4）×107，R2= 0.995 4，表明藻液A689 nm與細胞密度呈顯著正相關(guān)，說明藻液細胞密度可以用A689 nm值間接地表示。

圖4　藻液細胞密度與A689 nm相關(guān)性分析Fig. 4 Correlation between Algal cell density and A689 nm

2.2不同藻種的生長曲線及生長速率

在相同光照強度（200 μmol/（m2·s））、溫度（25± 1℃）和通氣量等培養(yǎng)條件下，8株微藻生長曲線如圖5所示，除了HY-B1藻株在第10 d時OD值開始下降和SF-B9仍然在對數(shù)期外，其余藻株在第10 d進入穩(wěn)定期后，至第13 d生物量的增長趨于穩(wěn)定。微藻培養(yǎng)周期內(nèi)出現(xiàn)的最高生物量（Maximal dry weight）作為評價其性能的指標較收獲時更具有科學(xué)性。圖6為8種藻種的比生長速率的比較，從圖中得知比生長速率最高的是SF-B9，達到0.419 7 d-1，說明SF-B9具有較高生物量積累能力，生長速度最快，其次比生長速率較高的還有SF-B1、HYB7和CC-B3。

圖5　微藻藻種的生長曲線圖Fig. 5 Growth curves of microalgae species

圖6　微藻的比生長速率曲線圖Fig. 6 Specific growth rates of microalgae species

2.3微藻生物量和油脂質(zhì)量分數(shù)的測定

對8種微藻的生物量和油脂質(zhì)量分數(shù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果如表2所示，生物量超過2 g/L的有5種，分別是HY-B3、HY-B7、SF-B1、SF-B9和CCB3，其中生物量最高的是SF-B9，達到2.69 g/L。

單位體積生物量產(chǎn)率可以反映藻細胞生物量的積累速率，由表2看出，生物量和單位體積生物量產(chǎn)率呈正相關(guān)，生物量高的其單位體積生物量產(chǎn)率也高，其中SF-B9的單位體積生物量產(chǎn)率為192 mg/（L·d）。

由表2看出，不同微藻藻種在相同培養(yǎng)條件下油脂的積累量具有明顯的差異。油脂含量超過40%的有兩種，分別是HY-B1和SF-B7，他們的油脂質(zhì)量分數(shù)分別達到43.20%和40.92%。油脂質(zhì)量分數(shù)在30%～40%之間有4種，分別是HY-B7、SF-B1、CC-B2、CC-B3。

表2　分離藻株生物量及油脂質(zhì)量分數(shù)的比較Table 2 Biomass concentrations and lipid contents of the collected strains

2.4微藻藻種的產(chǎn)油潛力評價

從表2可以看出，生物量產(chǎn)率高的藻種，油脂含量不一定高，因此利用生物量和油脂質(zhì)量分數(shù)作為產(chǎn)油藻種的評價標準較為片面，據(jù)此引入油脂產(chǎn)率作為重要的參考指標（評價指標），它是微藻油脂質(zhì)量分數(shù)與單位體積生物量產(chǎn)率的乘積，表示每天實際收獲的油脂量。8種微藻的油脂產(chǎn)率見圖7。從圖中可知8種微藻的油脂產(chǎn)率為34.9～62.9 mg/（L·d）。其中CC-B3的油脂產(chǎn)率最高，為62.9 mg/（L·d）。因此，選擇CC-B3為優(yōu)良藻種。

圖7　微藻的油脂產(chǎn)率比較Fig. 7 Comparison of microalgae oil yields

2.5 CC-B3藻株的鑒定分類

將PCR獲得的藻株CC -B3的18S rDNA（1 782 bp）在NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫中進行序列同源性比對，對獲得的相近細菌18S rDNA序列進行多序列匹配排列，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖8所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CC-B3與柵列藻屬親緣關(guān)系最近，與多個柵藻的18S rDNA序列相似度達到99%，初步確定該藻屬于斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）。

圖8　CC-B3的18S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 8 18S rDNA sequence phylogenetic tree of CC-B3

3　結(jié)語

作者從東北地區(qū)3個水域中分離出8種微藻，并對其進行產(chǎn)油水平評價，獲得油脂質(zhì)量分數(shù)超過30%的微藻有6株，其中有2株高于40%。試驗觀察到，微藻的油脂質(zhì)量分數(shù)與微藻培養(yǎng)物的顏色存在一定關(guān)系，油脂含量較高的藻株在培養(yǎng)后期，培養(yǎng)物的顏色發(fā)生明顯變化。

從生物量和油脂質(zhì)量分數(shù)分析可知，有的微藻的生物量高，但油脂質(zhì)量分數(shù)卻不高，如藻株SFB9生物量可達2.69 g/L，油脂質(zhì)量分數(shù)僅有26.48%；有的藻種的生物量低，油脂質(zhì)量分數(shù)卻較高，如藻株SF-B7的生物量為1.90 g/L，油脂質(zhì)量分數(shù)為40.92%。所以，應(yīng)該綜合生物量與油脂質(zhì)量分數(shù)來評價一株微藻是否符合高效產(chǎn)油微藻的性能。

以油脂產(chǎn)率作為重要的篩選條件，獲得的柵藻中，HY-B7、CC-B2和CC-B3的油脂質(zhì)量分數(shù)分別達到32.71%、31.54%、36.30%，油脂產(chǎn)率也高于國內(nèi)其他研究者所報道的水平，因此將選擇其確定為具有高效產(chǎn)油潛力的微藻藻種。后續(xù)擬開展其培養(yǎng)條件的優(yōu)化，以進一步提高其產(chǎn)油能力。

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Isolation and Characterization of Oil-Producing Microalgae

WANG Yurong1，2，SHI Wenjing1，TONG Mingyou*1，MAO Hailong2
（1. Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals of SINOPEC，F(xiàn)ushun 113001，China；2. Liaoning Shihua University，F(xiàn)ushun 113001，China）

Abstract：The oil contained in the microalgae was considered as an ideal raw material for biodiesel. In order to screen microalgae that have the potential to produce oil，eight strains of microalgae were isolated from natural water and evaluated for their growth，biomass and fat content. A highly efficient oil-producing microalga CC-B3 was found with the total lipid content 36.30%，biomass 2.43 g/L and oil yield 62.9 mg/（L·d）. Base on the 18s rRNA，the strain of algae was identified to be Scenedesmus obliquus and its phylogenetic tree was thus constructed.

Keywords：Oil-producing microalgae，separation and purification，screening，identification

*通信作者：佟明友（1955—），男，遼寧撫順人，理學(xué)博士，教授級高級工程師，主要從事生物質(zhì)能源研究。E-mail：tongmingyou@163.com

基金項目：中國石化集團微藻生物柴油成套技術(shù)開發(fā)項目（210080）。

收稿日期：2014-10-22

中圖分類號：TK 6；S 216.2

文獻標志碼：A

文章編號：1673—1689（2016）01—0077—05