祖　昕，　杜　凱，　曹　方，　孫玉梅（大連工業(yè)大學生物工程學院，遼寧大連116034）

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有機溶劑處理提高固定化脂肪酶活性及穩(wěn)定性

祖昕，杜凱，曹方，孫玉梅*
（大連工業(yè)大學生物工程學院，遼寧大連116034）

摘要：為提高固定化脂肪酶催化轉(zhuǎn)酯化反應的活性和穩(wěn)定性，采用活性炭、硅膠G和DM-130樹脂吸附固定脂肪酶LVK-F100，并用甲醇、丙酮、丙醇、異丙醇、乙酸乙酯、正己烷以及環(huán)己烷處理濕的固定化脂肪酶。結(jié)果表明，甲醇、正己烷和環(huán)己烷處理對固定化脂肪酶有鈍化作用，而丙酮、丙醇、異丙醇和乙酸乙酯處理能顯著提高固定化脂肪酶的活性。用乙酸乙酯和異丙醇處理吸附固定的脂肪酶1 h，可使固定化脂肪酶活力分別提高1.70～2.25倍、半衰期延長3.2～8.4 h、催化大豆油轉(zhuǎn)酯化反應延長使用周期2～5批。異丙醇和乙酸乙酯處理還可提高固定化脂肪酶的熱穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：脂肪酶；固定化；有機溶劑；活性；穩(wěn)定性

脂肪酶在工業(yè)上通常被用于催化有機媒介中的酯化或轉(zhuǎn)酯化反應。其在有機溶劑或無溶劑系統(tǒng)催化植物油酯化是制備生物柴油的環(huán)境友好工藝[1]。

酶的固定化技術(shù)解決了脂肪酶在酯化或轉(zhuǎn)酯化反應過程中易結(jié)塊、不易回收和重復利用等問題，提高了脂肪酶的活性和穩(wěn)定性[2]。吸附法固定化酶具有操作簡單、成本低、空間位阻小、在有機介質(zhì)中催化反應時脫附量較小、保留活性高、可再生等優(yōu)點[3]。固定化脂肪酶在有機介質(zhì)中的催化活性明顯低于在水相介質(zhì)中的催化活性，提高固定化酶在有機介質(zhì)中的催化活性和穩(wěn)定性具有很大的研究價值。

將游離脂肪酶溶解于某些純的極性有機溶劑或含有少量極性有機溶劑的水溶液中可以明顯提高脂肪酶的催化活性和穩(wěn)定性[4-6]。采用異丙醇干燥固定化酶可明顯提高固定化酶的活性和對映體選擇性[7]。一般認為極性有機溶劑改變了脂肪酶分子的構(gòu)象，促進了酶與底物的結(jié)合，從而提高酶的催化性能。但以極性有機溶劑處理固定化Candida Antarctica脂肪酶，未表現(xiàn)出酶活性和穩(wěn)定性的提高[8]。

采用不同載體在水相環(huán)境中吸附固定化脂肪酶（國產(chǎn)），用純有機溶劑處理濕的固定化脂肪酶，并采用處理的脂肪酶催化大豆油轉(zhuǎn)酯化反應，考察有機溶劑處理對固定化脂肪酶的催化活性和穩(wěn)定性的影響。

1　材料與方法

1.1材料

脂肪酶LVK-F100：10000 U/g，深圳市綠維康生物工程有限公司產(chǎn)品；牛血清蛋白（BSA）：美國Xiasi生物公司產(chǎn)品；硅膠G：青島裕民源硅膠試劑廠產(chǎn)品；吸水硅膠：深圳市紅葉杰科技有限公司產(chǎn)品；80-100、300-400目層析硅膠，青島裕民源硅膠試劑廠產(chǎn)品；DM-130大孔樹脂：山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司樹脂分廠產(chǎn)品；大豆油，大連日清制油有限公司產(chǎn)品；氣相色譜分析用脂肪酸甲酯標準品：美國SUPELCO公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1脂肪酶的固定化將15 g酶粉溶于300 mL磷酸緩沖液（50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4，pH 7.0），于室溫、200 r/min攪拌2 h后，于2 680 g離心10 min，得上清液。再用磷酸緩沖液稀釋上清液，制得濃度為0.05 mg/mL的脂肪酶液。分別將1 g經(jīng)預處理的活性炭、硅膠G以及DM-130樹脂加入30 mL上述酶液中，于30℃、150 r/min振蕩吸附2 h后，過濾出濕固定化酶，于4℃放置24 h。

1.2.2有機溶劑處理固定化脂肪酶取上述濕固定化酶1 g置于100 mL具塞三角瓶中，加入20 mL有機溶劑，于30℃、150 r/min振蕩處理1h，抽濾得處理過的固定化酶，于4℃放置24 h，測定脂肪酶活力。

選取作用效果較好的有機溶劑，按上述條件分別振蕩處理0.5～8 h，抽濾得處理過的固定化酶，于4℃放置24 h，測定脂肪酶活力。

1.2.3蛋白質(zhì)測定采用Bradford法[9]，使用牛血清蛋白為標準蛋白。

1.2.4固定化脂肪酶活力測定采用改進的橄欖油乳化法[10]。向150 mL 40 g/L的聚乙二醇溶液中加入50 mL橄欖油，混合均勻制成底物乳化液。在100 mL三角瓶中加入5 mL底物乳化液和4 mL的磷酸緩沖液（50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4，pH 7.0），于38℃預熱5 min，加入待測定的固定化脂肪酶，于38℃攪拌10 min，用10 mL體積分數(shù)95%的乙醇終止反應。以酚酞為指示劑，用0.025 mol/L的NaOH滴定水解產(chǎn)生的脂肪酸。

酶活力定義：在38℃、pH 7.0的條件下，每分鐘水解橄欖油產(chǎn)生1 μmol脂肪酸所需的酶量為一個酶活單位（U）。

1.2.5固定化脂肪酶催化大豆油轉(zhuǎn)酯化將22.5 g大豆油、11 mL正己烷及1 g固定化脂肪酶置于250 mL具塞三角瓶中，經(jīng)30℃預熱15 min，按醇油摩爾比3∶1，從反應開始每8 h等摩爾加入無水甲醇3次，于150 r/min振蕩反應24 h。將轉(zhuǎn)酯化反應液在0.1 MPa減壓蒸餾，收集140℃～200℃脂肪酸甲酯組份，進行氣相色譜定量分析。

1.2.6大豆油的完全甲酯化取1 g大豆油置于50 mL具塞三角瓶中，加入5 %的KOH-甲醇溶液2 mL，于75℃水浴中皂化15 min，再加入14 %的三氟化硼乙醚溶液2 mL，振蕩反應2 min，待冷卻至室溫后，加入1 mL正己烷，充分振蕩后靜置，取上清液進行氣相色譜定量分析。

1.2.7脂肪酸甲酯測定采用山東經(jīng)緯GC8900型氣相色譜儀，PEG-20M（30 m×0.32 mm×0.35 μm）毛細管柱；柱箱溫度180℃，汽化室溫度250℃，F(xiàn)ID檢測器溫度250℃；載氣為氮氣，柱前壓0.1 MPa；氫氣流量30 mL/min，空氣流量50 mL/min；進樣量0.4 μL，無分流。

1.2.8大豆油的脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)化率X計算計算公式如下：

1.2.9固定化酶半衰期測定轉(zhuǎn)酯化反應結(jié)束后，用15 mL丙酮分3次洗滌固定化脂肪酶，過濾分離固定化脂肪酶，于4℃干燥24 h，測定其脂肪酶活力，根據(jù)Inverted linear decay model計算固定化酶半衰期t1/2[11-12]。

1.2.10固定化酶熱穩(wěn)定性測定將1 g固定化酶置于100 mL三角瓶，加入20 mL磷酸緩沖液（50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4，pH 7.0），分別置于30℃～70℃水浴搖床中振蕩1 h，反應結(jié)束后，過濾分離固定化脂肪酶，于4℃放置24 h，測定其脂肪酶活力。

2　結(jié)果與討論

2.1不同有機溶劑處理對固定化脂肪酶活力的影響

以40目活性炭、硅膠G以及DM-130樹脂吸附固定脂肪酶，再用不同有機溶劑處理固定化脂肪酶，處理前后的固定化脂肪酶相對酶活見表1。

表1　不同有機溶劑處理的固定化脂肪酶相對酶活Table 1 Relative activities of immobilized lipases treated by various organic solvents

由表1可知，甲醇、正己烷和環(huán)己烷對固定化脂肪酶有鈍化作用，而丙酮、丙醇、異丙醇、乙酸乙酯明顯提高了固定化脂肪酶的活性，對硅膠G和DM-130樹脂吸附固定脂肪酶的處理效果較好。

水因直接或間接參與所有的非共價相互作用而維持脂肪酶催化部位的構(gòu)象[13-14]。丙酮、丙醇、異丙醇、乙酸乙酯的極性較大，與水的親和作用較大，能吸收濕固定化脂肪酶結(jié)構(gòu)中的多余水分，激活脂肪酶分子上某些處于關(guān)閉狀態(tài)的活性部位，改變脂肪酶的分子構(gòu)象，促進酶與底物的結(jié)合[15]，而且有利于固定化酶的干燥。用具有較大極性的甲醇處理后的脂肪酶活力降低很多。而正己烷和環(huán)己烷的極性較小，與固定化脂肪酶結(jié)構(gòu)中的水親和作用較小，使固定化脂肪酶結(jié)構(gòu)中的水較多殘留，從而降低脂肪酶催化活性[16-17]。因此，有機溶劑對固定化脂肪酶的作用與溶劑極性強弱及其相關(guān)基團有關(guān)。

有機溶劑對固定化脂肪酶的作用還與溶劑分子的結(jié)構(gòu)以及酶在載體上的吸附狀態(tài)有關(guān)。Wu等[15]采用極性相同的辛烷和異辛烷處理表面包被的脂肪酶，發(fā)現(xiàn)辛烷和異辛烷對固定化脂肪酶均有鈍化作用，且辛烷的鈍化作用明顯高于異辛烷。Park等[1]證明了固定化脂肪酶的多層包被或皺褶結(jié)構(gòu)會形成空間位阻，阻礙底物與脂肪酶的接觸以及反應產(chǎn)物的擴散，也會阻礙有機溶劑與脂肪酶分子的接觸，降低極性溶劑的激活作用。

2.2有機溶劑處理時間對固定脂肪酶活力的影響

用乙酸乙酯處理活性炭吸附固定的脂肪酶，用異丙醇處理硅膠G、DM-130樹脂吸附固定的脂肪酶，經(jīng)處理不同時間的固定化脂肪酶相對酶活力如圖1所示。

圖1　不同有機溶劑處理時間的固定化脂肪酶相對酶活力Fig. 1 Relative activities of immobilized lipases treated by organic solvents for various time

由圖1可知，乙酸乙酯處理活性炭吸附固定脂肪酶以及異丙醇處理硅膠G、DM-130樹脂吸附固定脂肪酶的適宜時間均為1 h，隨著處理時間的延長，酶活力不斷下降。乙酸乙酯和異丙醇與固定化脂肪酶結(jié)構(gòu)中的水親和作用較大，雖然適當浸泡能吸收濕固定化脂肪酶結(jié)構(gòu)中多余的水分，有利于穩(wěn)定固定化脂肪酶分子構(gòu)象和減少固定化脂肪酶結(jié)構(gòu)中的非必需水，但較長時間浸泡會延長溶劑與其中水的親和作用時間，剝奪固定化脂肪酶的必需水，破壞了脂肪酶的分子構(gòu)象，導致部分脂肪酶變性失活。已有研究表明適量的極性有機溶劑處理對載體吸附酶量沒有影響[18]。

2.3有機溶劑處理對固定化脂肪酶熱穩(wěn)定性的影響

用乙酸乙酯處理活性炭吸附固定的脂肪酶1 h，用異丙醇處理硅膠G、DM-130樹脂吸附固定的脂肪酶1 h，經(jīng)有機溶劑處理與未經(jīng)處理的固定化脂肪酶在不同溫度下的相對酶活力如圖2所示。

與未經(jīng)有機溶劑處理的固定化脂肪酶相比，經(jīng)乙酸乙酯處理的活性炭吸附固定脂肪酶和經(jīng)異丙醇處理的硅膠G吸附固定脂肪酶在各溫度下的酶活力均較高，說明極性有機溶劑處理能提高固定化脂肪酶的熱穩(wěn)定性。但經(jīng)異丙醇處理的硅膠G吸附固定的脂肪酶比經(jīng)乙酸乙酯處理的活性炭吸附固定的脂肪酶具有更好的高溫穩(wěn)定性，這與活性炭孔隙較大，被吸附固定的酶呈片層堆積有關(guān)[19]。

圖2　經(jīng)有機溶劑處理的固定化脂肪酶熱穩(wěn)定性Fig. 2 Thermal stability of immobilized lipases treated by organic solvents

2.4有機溶劑處理對固定化脂肪酶半衰期的影響

用乙酸乙酯處理活性炭吸附固定的脂肪酶1 h，用異丙醇處理硅膠G、DM-130樹脂吸附固定的脂肪酶1h，經(jīng)有機溶劑處理與未經(jīng)處理的固定化脂肪酶半衰期如圖3所示。

圖3　經(jīng)有機溶劑處理的固定化脂肪酶半衰期Fig. 3　 Half -lives of immobilized lipases treated by organic solvents

由圖3可知，與未經(jīng)有機溶劑處理的相應固定化脂肪酶相比，經(jīng)乙酸乙酯處理的活性炭吸附固定脂肪酶半衰期延長6.6 h，是未處理對照的1.1倍，經(jīng)異丙醇處理的硅膠G吸附固定脂肪酶的半衰期延長8.4 h，是未處理對照的1.1倍，經(jīng)異丙醇處理的MD-130樹脂吸附固定脂肪酶半衰期延長3.2 h，是未處理對照的1.04倍。可見，極性有機溶劑處理能有效延長固定化酶的半衰期。一般認為，酶活力下降的主要原因是反應過程中酶分子活性部位的鈍化和酶蛋白結(jié)構(gòu)的變性失活，但酶蛋白結(jié)構(gòu)改變并不一定導致酶活力下降[20]。適量的極性有機溶劑處理雖然改變了酶分子的部分結(jié)構(gòu)，但卻增強了脂肪酶的催化活性，并且穩(wěn)定了酶分子的構(gòu)象，延長了半衰期。硅膠G具有極性，對極性有機溶劑也有較強吸附作用，能促使極性有機溶劑進入到包被或載體結(jié)構(gòu)的內(nèi)部[19]，對脂肪酶的激活或穩(wěn)定作用效果更明顯。

2.5有機溶劑處理對固定化脂肪酶操作穩(wěn)定性的影響

用乙酸乙酯處理活性炭吸附固定的脂肪酶1 h，用異丙醇處理硅膠G、DM-130樹脂吸附固定的脂肪酶1 h，經(jīng)有機溶劑處理與未經(jīng)處理的固定化脂肪酶重復應用于催化大豆油轉(zhuǎn)酯化反應的酯轉(zhuǎn)化率如圖4所示。

由圖4可見，在酯轉(zhuǎn)化率不低于50%的情況下，與未經(jīng)有機溶劑處理的相應固定化脂肪酶相比，經(jīng)乙酸乙酯處理的活性炭吸附固定脂肪酶多用5批次，是未處理對照的1.6倍，經(jīng)異丙醇處理的硅膠G吸附固定脂肪酶多用3批次，是未處理對照的1.3倍，經(jīng)異丙醇處理的MD-130樹脂吸附固定脂肪酶多用2批次，是未處理對照的1.2倍?？梢?，極性有機溶劑處理能有效延長固定化脂肪酶催化大豆油轉(zhuǎn)酯化反應的使用壽命。經(jīng)極性有機溶劑處理，增強了固定化脂肪酶對正己烷和甲醇的耐受性，從而增強其在大豆油、正己烷和甲醇反應環(huán)境中催化轉(zhuǎn)酯化反應的穩(wěn)定性。經(jīng)乙酸乙酯處理的活性炭吸附固定脂肪酶的使用壽命明顯高，是活性炭結(jié)構(gòu)、吸附固定脂肪酶的方式和狀態(tài)以及乙酸乙酯的處理效果使然。

圖4　經(jīng)有機溶劑處理的固定化脂肪酶的循環(huán)利用效果Fig. 4　 Recycling use of immobilized lipases with treatment in polar organic solvents

3　結(jié)語

有機溶劑對固定化脂肪酶LVK-F100的作用與溶劑極性強弱及其相關(guān)基團以及酶在載體上的吸附狀態(tài)有關(guān)，較強極性的丙酮、丙醇、異丙醇、乙酸乙酯明顯提高了固定化脂肪酶的活性，對硅膠G 和DM-130樹脂吸附固定脂肪酶的處理效果普遍較好。而甲醇、正己烷和環(huán)己烷對固定化脂肪酶有鈍化作用。

綜合評價，用乙酸乙酯處理活性炭吸附固定的脂肪酶以及用異丙醇處理硅膠G吸附固定的脂肪酶，在酶活性、熱穩(wěn)定性、半衰期以及催化大豆油轉(zhuǎn)酯化使用壽命方面均有較明顯的改善作用。而硅膠G吸附固定的脂肪酶比活性炭吸附固定的脂肪酶具有更好的高溫穩(wěn)定性。經(jīng)乙酸乙酯處理的活性炭吸附固定脂肪酶的使用壽命明顯高。從而增加了固定化脂肪酶應用的可能性并降低其催化反應的成本。

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Treatment of Organic Solvents to Improve Activity and Stability of Immobilized Lipases

ZU Xin，DU Kai，CAO Fang，SUN Yumei*
（School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China）

Abstract：The lipases immobilized on active carbon，silica gel G or DM-130 macro porous resin by adsorption were steeped in various organic solvents to improve the activity and stability for catalyzing transesterification. It was found that the activities of immobilized lipases could be increased with acetone，1-propanol，2-propanol and ethyl acetate，but could be deactivated with methanol，n-hexane and cyclohexane. Compared with the immobilized lipases dried directly after adsorption，the immobilized lipases treated in 2-propanol or ethyl acetate for 1 h displayed 1.70 to 2.25 times enzyme activities，their half-lives were prolonged 3.2 to 8.4 h and the operation lives were increased 2 to 5 batches for soybean oil transesterification. The thermal stability of the immobilized lipases could also be enhanced by the treatment with 2-propanol or ethyl acetate.

Keywords：lipase，immobilization，organic solvent，activity，stability

*通信作者：孫玉梅（1962—），女，吉林吉林人，教授，主要從事微生物代謝控制發(fā)酵研究。E-mail：sunyumei62@163.com

基金項目：遼寧省教育廳創(chuàng)新團隊項目（LT2011008）；遼寧省科技廳遼寧省發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心項目（遼科發(fā)200923）。

收稿日期：2014-11-24

中圖分類號：Q 814

文獻標志碼：A

文章編號：1673—1689（2016）01—0089—06