張　玨，　沈　潔，　隋曉辰，　劉昱均（.衛(wèi)生部核醫(yī)學重點實驗室/江蘇省原子醫(yī)學研究所，江蘇無錫4063；.食品科學與技術國家重點實驗/江南大學，化學與材料工程學院，江蘇無錫4）

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微波輔助合成硫酸化發(fā)酵靈芝胞外多糖的研究

張玨1，沈潔2，隋曉辰2，劉昱均2
（1.衛(wèi)生部核醫(yī)學重點實驗室/江蘇省原子醫(yī)學研究所，江蘇無錫214063；2.食品科學與技術國家重點實驗/江南大學，化學與材料工程學院，江蘇無錫214122）

摘要：多糖的硫酸化修飾能提高多糖的生物活性。從靈芝深層發(fā)酵液中獲取靈芝胞外多糖，以二甲基甲酰胺為反應溶劑，采用氨基磺酸為酯化劑，探討了微波輔助加熱合成多糖的途徑。結果表明，將尿素作為催化劑微波輔助合成硫酸酯化多糖，反應條件溫和，取代度可高達2.67。因此微波輔助合成法為獲取高取代度硫酸化靈芝多糖開辟了一條新途徑。

關鍵詞：靈芝；多糖；硫酸化；發(fā)酵

靈芝多糖為靈芝中最重要的活性成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調節(jié)等藥理活性[1-3]。隨著現代生物工程技術的發(fā)展，通過液態(tài)深層發(fā)酵可規(guī)模化定向獲取靈芝多糖[4-5]。但發(fā)酵靈芝胞外多糖的抗腫瘤活性卻并不理想[6]。為解決這一問題，通過多糖的硫酸化修飾來提高多糖的生物活性[7-9]。研究表明，靈芝胞外多糖經硫酸化修飾后其抗肝癌活性明顯提高，且硫酸化取代度（DS）與其生物活性密切相關[10-13]。目前對靈芝多糖硫酸化修飾的研究多集中于子實體多糖[14-15]，關于發(fā)酵靈芝多糖硫酸化的報道相對較少[8]。在多糖硫酸化工藝上多采用氯磺酸酯化法[12，16-17]，并且以傳統(tǒng)的常規(guī)加熱方式來提供能量，這就帶來了反應時間長、副反應多、取代度較?。―S=0.8-1.5）等弊端[10，12，18-19]。對于合成高取代度的硫酸酯化多糖的報道更為少見[20]，另外以氨基磺酸作為酯化試劑的報道也相對較少[21]。

微波輔助合成技術利用微波替代傳統(tǒng)的加熱方式，可降低反應活化能，提高反應速率，具有高轉化率、高選擇性、低能耗、清潔環(huán)保等特點[22]。作者采用微波輔助合成法對靈芝胞外多糖進行硫酸化修飾，考察各因素對取代度的影響，旨在得到一條高效、可控、取代度高、反應條件溫和的多糖硫酸化合成途徑。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

發(fā)酵靈芝胞外多糖：江南大學章克昌教授實驗室提供；無水硫酸鈉、N，N-二甲基甲酰胺、苯酚、吡啶、濃硫酸、乙醇、氯化鋇、氫氧化鈉、甲酰胺、氨基磺酸：AR，國藥集團化學試劑有限公司產品；明膠：Amresco生物科技有限公司產品；氯磺酸：CP，上海金山亭化工試劑廠產品。

微波催化合成萃取儀：XH-100A，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司產品；紫外分光光度計：T-6，普析通用儀器有限責任公司產品；透析袋：截留相對分子質量3 500，美國Viskase公司產品；冷凍干燥機：EZ585Q，美國FTS System公司產品；旋轉蒸發(fā)儀：RE-52，上海本波儀器有限公司產品。

1.2方法

1.2.1硫酸酯化靈芝胞外多糖的制備流程將一定量的靈芝胞外多糖加入裝有二甲基甲酰胺的燒瓶中，室溫下攪拌30 min使多糖均勻分散在溶劑中。將燒瓶放入微波反應器中，選擇恒溫模式，一定溫度下預熱30 min后緩慢加入氨基磺酸，設置反應所需的微波功率。反應結束后迅速將燒瓶置于冰水浴中，反應液用4 mol/L NaOH調節(jié)pH至7后用體積分數90%乙醇沉淀，離心取沉淀。沉淀先用90%乙醇洗滌再用去離子水復溶，用流水透析24 h。透析袋內液體冷凍干燥后即得靈芝胞外硫酸化多糖。

1.2.2硫酸基含量測定：采用BaCl2-明膠濁度法采用BaCl2-明膠濁度法[23]，取代度（DS）計算公式：

DS=（1.62×S）/（32－1.02×S），其中S%為硫質量分數。

2　結果與討論

2.1硫酸酯化試劑的篩選

硫酸基團的引入影響著多糖的生物活性，硫酸酯化試劑則對反應有一定的影響。作者分別考察了氯磺酸和氨基磺酸對取代度的影響。

從圖1可看出，氯磺酸和氨基磺酸在各自最佳反應溫度下的取代水平相似，但氨基磺酸對反應溫度更為寬泛。相比用氯磺酸合成的硫酸酯化靈芝多糖，氨基磺酸法合成的硫酸酯化靈芝多糖色澤較淺，反應過程溫和。

圖1　不同硫酸酯化試劑對DS的影響Fig. 1 Effectof sulfuric acid esterification reagent on DS

2.2微波輔助合成對取代度的影響

氨基磺酸是一種溫和的硫酸酯化試劑。在微波合成反應中，通過極性分子的偶極旋轉和離子傳導兩種作用將能量直接傳遞到反應物上。同時，分子的整體運動能夠活化分子，有利于其形成過渡態(tài)，從而降低反應體系的活化能，最終使反應速率加快，選擇性提高。

微波輻射對多糖硫酸酯化的影響見圖2。采用微波法合成硫酸酯化多糖具有反應時間短，轉化率高等優(yōu)點。但這也提高了對溫度的選擇性。溫度過低（＜80℃）不利于反應充分進行，而溫度過高（＞90℃）則導致氨基磺酸分解，同樣降低了取代度。反應溫度為90℃時，多糖硫酸化的取代度達到最大為1.37，并且產物顏色較淺，說明副產物較少。因此，作者選取90℃為最佳的合成溫度。

圖2　微波輻射溫度對靈芝胞外多糖硫酸酯化取代度的影響Fig. 2 Effect of reaction temperature on DS

2.3微波輻射功率對取代度的影響微波輻射功率通過影響體系的溫度和反應初速度來影響反應的取代度。由圖3可知，微波功率在100～300 W時，微波提供的能量較低，體系僅處于微波輻射加熱狀態(tài)，無法有多余的能量傳遞到反應分子上使其活化。當微波功率高于400 W時，體系能維持最適反應溫度90℃，并有一定的能量傳遞到反應分子上，且在一定范圍內取代度隨功率增加而增大。當功率超過500 W時，硫酸酯化胞外多糖的取代度有所增加但并不顯著。這可能是由于過大的功率導致反應溫度上升，從而不利于取代度的提高。綜上所述，500 W為最佳的微波輻射功率。

圖3　微波輻射功率對靈芝胞外多糖硫酸酯化取代度的影響Fig. 3 Effect of microwave radiation power on DS

2.4微波輻射時間對取代度的影響

微波輻射時間對靈芝胞外多糖硫酸酯化取代度的影響見圖4。在微波功率為500 W、輻射時間超過120 s時，靈芝胞外多糖硫酸酯化取代度明顯提高。但隨著反應時間的延長，取代度并未明顯增大?？紤]到微波輻射下各底物偶極矩的強烈變化可能對反應物和產物的穩(wěn)定性帶來不確定因素。并且反應時間過短不利于反應充分進行，反應時間過長則加劇氨基磺酸分解。故選取微波輻射反應時間為240 s。

圖4　微波輻射時間對靈芝胞外多糖硫酸酯化取代度的影響Fig. 4 Effect of microwave radiation time on DS

2.5反應物料摩爾比及催化劑在微波輔助合成中對取代度的影響

在微波輔助合成反應物中，反應物的分子極性越大，偶極旋轉越強，產生的熱量也越大，從而提高了微波的效能作用，由此增大了反應體系中反應物分子的碰撞頻率或有效碰撞的幾率。因此，有必要探討微波合成中多糖與氨基磺酸的摩爾比。此外，催化劑的存在也是影響酯化反應速率的重要因素。微波輻射在加速多糖的氨基磺酸酯化速率的同時也不可避免地導致氨基磺酸的分解。而尿素的加入能有效緩解這一問題。在微波輻射反應中將尿素作為催化劑不僅加快了反應速率，提高硫酸酯化多糖的取代度，還提高了氨基磺酸的利用率。

從圖5結果可看到，在沒有催化劑的情況下，多糖與氨基磺酸摩爾比的增大使得取代度略有增加。當物料摩爾比為1∶3時，對應的取代度為1.5。將尿素作為催化劑，物料摩爾比超過1∶2時，取代度明顯增大。這表明在微波場中，尿素的催化性能得到顯著提高，有效提高了底物轉化率。并且在反應時間僅為4 min時獲得的硫酸化靈芝胞外多糖的取代度高達2.63，高于目前已有文獻所報道的取代度。

圖5　尿素在微波輔助合成硫酸酯化靈芝胞外多糖取代度的影響Fig. 5 Effect of urea under microwave radiation on DS

3　結語

以氨基磺酸為硫酸化試劑，對微波輔助合成硫酸化發(fā)酵靈芝胞外多糖的工藝條件進行了探討。由此獲得最佳工藝條件為：微波輔助反應溫度為90℃，反應時間為4 min，微波功率為500 W，物料比（多糖的單糖殘基與氨基磺酸摩爾比）為1∶3，催化劑尿素的用量為氨基磺酸質量的25%。在該條件下獲得的硫酸化發(fā)酵靈芝胞外多糖的取代度高達2.67。并且該反應快速溫和、易控制。由此可見，微波輔助法合成硫酸化多糖是一種易于規(guī)模化、能獲取高取代度的合成方法。

參考文獻：

[1]WANG J G，MA Z C，ZHANG L N，et al. Structure and chain conformation of water-soluble heteropolysaccharides from Ganoderma lucidum[J]. Cabohydrate Polymer，2011，86（2）：844-851.

[2]HUANG S Q，LI J W，LI Y Q，et al. Purification and structural characterization of a new water-soluble neutral polysaccharide GLP-F1-1 from Ganoderma lucidum[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2011，48（1）：165-169.

[3]LIU W，WANG H Y，PANG X B，et al. Characterization and antioxidant activity of two low-molecular-weight polysaccharides purified from the fruiting bodies of Ganoderma lucidum[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2010，46 （4）：451-457.

[4]LIU G Q，WANG X L，HAN W J，et al. Improving the fermentation production of the individual key triterpene ganoderic acid me by the medicinal fungus Ganoderma lucidum in submerged culture[J]. Molecules，2012，17（11）：12575-12586.

[5]Chien Y L，Ho C T，Chiang B H，et al. Effect of fermentation time on antioxidative activities of Ganoderma lucidum broth using leguminous plants as part of the liquid fermentation medium[J]. Food Chemistry，2011，126（4）：1586-1592.

[6]ZHANG J，LIU Y J，Park H S，et al. Antitumor activity of sulfated extracellular polysaccharides of Ganoderma lucidum from the submerged fermentation broth[J]. Cabohydrate Polymer，2012，87（2）：1539-1544.

[7]ZHAI Q Z，LI X L，YANG Y Z，et al. Antitumor activity of a polysaccharide fraction from Laminaria japonica on U14 cervical carcinoma-bearing mice[J]. Tumor Biology，2014，35（1）：117-122.

[8]WU X D，JIANG W，LU J J，et al. Analysis of the monosaccharide composition of water-soluble polysaccharides from Sargassum fusiforme by high performance liquid chromatography/electrospray ionisation mass spectrometry[J]. Food Chemistry，2014，145：976-983.

[9]WANG X X，CHEN Y，WANG J J，et al. Antitumor activity of a sulfated polysaccharide from Enteromorpha intestinalis targeted against hepatoma through mitochondrial pathway[J]. Tumor Biology，2014，35（2）：1641-1647.

[10]LIU W，WANG H Y，YAO W B，et al. Effects of sulfation on the physicochemical and functional properties of a water-insoluble polysaccharide preparation from Ganoderma lucidum[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistryistry，2010，58（6）：3336-3341.

[11]FENG Y L，LI W Q，WU X Q，et al. Rapid and efficient microwave-assisted sulfate modification of lentinan and its antioxidant and antiproliferative activities in vitro[J]. Cabohydrate Polymer，2010，82（3）：605-612.

[12]CHEN T，LI B，LI Y，et al. Catalytic synthesis and antitumor activities of sulfated polysaccharide from Gynostemma pentaphyllum Makino[J]. Cabohydrate Polymer，2011，83（2）：554-560.

[13]Dore C，Alves M，Santos N D，et al. Antiangiogenic activity and direct antitumor effect from a sulfated polysaccharide isolated from seaweed[J]. Microvascular Research，2013，88：12-18.

[14]CHEN Y，XIE M Y，NIE S P，et al. Purification，composition analysis and antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies of Ganoderma atrum[J]. Food Chemistry，2008，107（1）：231-241.

[15]FAN L P，LI J W，DENG K Q，et al. Effects of drying methods on the antioxidant activities of polysaccharides extracted from Ganoderma lucidum[J]. Cabohydrate Polymer，2012，87（2）：1849-1854.

[16]WANG Y，SHEN X K，LIAO W F，et al. A heteropolysaccharide，L-fuco-D-manno-1，6-alpha-D-galactan extracted from Grifola frondosa and antiangiogenic activity of its sulfated derivative[J]. Cabohydrate Polymer，2014，101：631-641.

[17]QIAN X P，ZHA X Q，XIAO J J，et al. Sulfated modification can enhance antiglycation abilities of polysaccharides from Dendrobium huoshanense[J]. Cabohydrate Polymer，2014，101：982-989.

[18]YAN J K，WANG W Q，MA H L，et al. Sulfation and enhanced antioxidant capacity of an exopolysaccharide produced by the medicinal fungus cordyceps sinensis[J]. Molecules，2013，18（1）：167-177.

[19]Jindal M，Rana V，Kumar V，et al. Sulfation of Aegle marmelos gum：Synthesis，physico-chemical and functional characterization[J]. Cabohydrate Polymer，2013，92（2）：1660-1668.

[20]CHEN T，WANG J，LI Y Y，et al. Sulfated modification and cytotoxicity of Portulaca oleracea L. polysaccharides[J]. Glycoconjugate Journal，2010，27（6）：635-642.

[21]陳群.茯苓硫酸酯化多糖的制備及其核磁共振波譜分析[J].安徽農業(yè)科學，2010，38（1）：3.

[22]Wan H-d，Sun S-y，Hu X-y，et al. Nonthermal effect of microwave irradiation in nonaqueous enzymatic esterification[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2012，166（6）：1454-1462.

[23]張惟杰.糖復合物生化研究技術[M].浙江：浙江大學出版社，1994.

Microwave Assisted Synthesis of Sulfated Extracellular Polysaccharide from Submerged Fermentation of Ganoderma Lucidum

ZHANG Jue1，SHEN Jie2，SUI Xiaochen2，LIU Yujun2
(1. Key Laboratory of Nuclear Medicine of Ministry of Health / Jiangsu Institute of Nuclear Medicine，Wuxi 214063，China；2 State Key Laboratory of Food Science and Technology / School of College of Chemical & Material Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Abstract：Sulfation of polysaccharides can improve their biological activities. To efficiently prepare the sulfated extracellular polysaccharide from submerged fermentation of Ganoderma Lucidum，microwave assisted synthesis was established in this paper，using dimethylformamide as solvent and aminosulfonic acid as esterifying reagent. Results showed that the microwave assisted synthesis with urea as catalyst led to a high substitution degree of 2.67，and the reaction was mild. Thus，microwave assisted synthesis is a new approach to obtain sulfated polysaccharides with high degree of substitution.

keywords：Ganoderma Lucidum，polysaccharide，sulfation，submerged fermentation

作者簡介：張玨（1969—），女，上海人，工學博士，副研究員，主要從事天然產物提取研究。E-mail：zhangjue@jsinn.org

基金項目：中央高校自主科研項目（JUSRP11517）；食品科學與技術國家重點實驗室自由探索基金項目（SKLF-ZZB-201504）；無錫市科技支撐計劃—社會發(fā)展項目（CSE01N1239）。

收稿日期：2014-08-08

中圖分類號：O 657.3

文獻標志碼：A

文章編號：1673—1689（2016）01—0107—05