黃聰亮，　鄭佳俐，　李鳳林，　宮敬利（1．漳州職業(yè)技術(shù)學院食品與生物工程系，福建漳州6000；2.農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高校應(yīng)用技術(shù)工程中心，福建漳州6000；.吉林農(nóng)業(yè)科技學院食品工程學院，吉林吉林12101）

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茯苓多糖對2型糖尿病小鼠腎組織抗氧化能力及Bax、Bcl-2蛋白表達影響

黃聰亮1，2，鄭佳俐1，2，李鳳林3，宮敬利3
（1．漳州職業(yè)技術(shù)學院食品與生物工程系，福建漳州363000；2.農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高校應(yīng)用技術(shù)工程中心，福建漳州363000；3.吉林農(nóng)業(yè)科技學院食品工程學院，吉林吉林132101）

摘要：研究探討茯苓多糖（WRP）對2型糖尿?。∟IDDM）小鼠腎組織抗氧化能力及Bax、Bcl-2蛋白表達影響。采用高糖高脂飼料＋小劑量鏈脲佐菌素（STZ）方式誘導(dǎo)NIDDM動物模型，然后將動物分成正常對照組、模型對照組、WRP灌胃組、羅格列酮灌胃組，藥物連續(xù)灌胃42 d，檢測小鼠腎組織抗氧化能力以及Bax和Bcl-2蛋白的表達。結(jié)果表明，WRP能使NIDDM小鼠腎組織中超氧化物岐化酶、谷胱甘肽過氧化物酶水平明顯升高，丙二醛的水平明顯降低；即WRP能增強機體腎臟的抗氧化性，降低脂質(zhì)過氧化，保護自由基介導(dǎo)的氧化損傷，減輕糖尿病對腎臟的損害。WRP能抑制NIDDM小鼠腎組織中Bax基因過多表達；使糖尿病狀態(tài)下腎組織細胞凋亡趨勢受到抑制，對糖尿病腎病具有一定預(yù)防作用。

關(guān)鍵詞：茯苓多糖；2型糖尿??；腎組織；Bax；Bcl-2

糖尿?。―M）是一種因體內(nèi)胰島素絕對或者相對不足所導(dǎo)致的慢性代謝性疾病，其不僅能導(dǎo)致高血糖癥，同樣還會引起許多并發(fā)癥[1]。其中，糖尿病腎?。―N）是DM最常見的嚴重微血管并發(fā)癥，近年來在我國的發(fā)病率亦呈上升趨勢，在早、中期以臟體積增大、血壓增高、持續(xù)性蛋白尿、低蛋白血癥等為主要特征，晚期則發(fā)展為終末期糖尿病腎病，出現(xiàn)氮質(zhì)血癥、腎功能衰竭等。統(tǒng)計資料表明，目前由糖尿病腎病造成的腎功能衰竭比非糖尿病患者高17倍，是糖尿病患者主要死亡原因之一[2-3]。研究表明，細胞凋亡與DN的發(fā)病機制有直接的關(guān)系，是導(dǎo)致胰島β細胞數(shù)目逐漸減少的主要原因[4-5]。Bcl-2是一個抑制凋亡的基因，其蛋白表達產(chǎn)物能抑制細胞凋亡；Bcl-2家族中還包括它的同源蛋白Bcl-x1、Bcl-xs、Bax等。Bcl-2與Bax形成同源二聚體時，便可誘導(dǎo)凋亡；Bcl-2與Bax蛋白表達水平的高低與細胞凋亡有密切關(guān)系[6-9]。作者前期已對茯苓多糖（WRP）抗2型糖尿?。∟IDDM）的作用及其機理進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)中、高劑量（100、200 mg/kg）的WRP能有效降低NIDDM小鼠高血糖、血脂的水平，改善IR狀態(tài)，且高劑量（200 mg/kg）效果最佳。為進一步研究WRP對NIDDM小鼠腎臟保護作用，作者采用高劑量WRP（200 mg/kg）灌胃NIDDM小鼠，通過測定腎組織中超氧化物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）和丙二醛（MDA）含量；免疫組化SP法檢測腎組織中Bax和Bcl-2蛋白表達來評價其保護作用，為WRP的進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

茯苓：購買于漳州藥材市場；鏈脲佐菌素（STZ）：購于美國Sigma有限公司；羅格列酮（文迪雅，Rosiglitazone）：購于葛蘭素史克（天津）有限公司；SOD、GPx、MDA試劑盒：購于南京建成生物工程研究所；兔抗鼠Bax單克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2單克隆抗體、鼠、兔免疫組化試劑盒、DAB（對二氨基聯(lián)苯）顯色試劑盒：購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其它化學試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海榮生化儀器廠產(chǎn)品；中草藥萬能粉碎機：江陰市偉翔藥化機械廠產(chǎn)品；Gel Doc XR System凝膠成像系統(tǒng)：美國Gene公司產(chǎn)品；SMZ1500熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)：日本尼康公司產(chǎn)品；ALCYON 300全自動生化分析儀：美國Abbott公司產(chǎn)品；超純水制備機：美國PureLab Plus公司產(chǎn)品。

1.3試驗動物

健康雄性昆明系小鼠（體重20.0±2.0 g）由吉林市生物制品廠提供。動物分籠飼養(yǎng)于標準化清潔級飼養(yǎng)室（使用許可證號：JLNSPX211-0037），室內(nèi)溫度控制在（23±2）℃，相對濕度控制在（50± 5）%。小鼠自由攝食與飲水，提供標準嚙齒類動物飼料（配方為：質(zhì)量分數(shù)20%蛋白質(zhì)＋60%碳水化合物＋9%脂肪＋11%纖維素）。動物試驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d以適應(yīng)環(huán)境。試驗動物照顧按照國家《實驗動物管理條例》與國際通用《實驗動物護理和使用指南（NAP）》進行，并分別經(jīng)漳州職業(yè)技術(shù)學院實驗動物福利與倫理委員會及吉林農(nóng)業(yè)科技學院實驗動物倫理委員會批準。

1.4試驗方法

1.4.1茯苓多糖提取將塊狀茯苓清理干凈，粉碎后過100目篩獲茯苓粉；將茯苓粉按1 g∶5 mL比例加入石油醚，回流脫脂2次，每次1.5 h，濾去石油醚，濾渣揮干后獲預(yù)處理茯苓粉。按1 g∶10 mL加入蒸餾水，90℃下提取8 h左右，離心除去殘渣。濾液減壓濃縮，4℃下進行醇析、離心，所得沉淀用乙醇、丙酮及乙醚反復(fù)洗滌數(shù)次，干燥后得茯苓粗多糖（WRP）。

1.4.2 NIDDM動物模型的建立與分組采用高糖高脂飼料+小劑量STZ方式誘導(dǎo)NIDDM動物模型。取100只雄性小鼠，給予高糖高脂飼料（配方為：質(zhì)量分數(shù)10%蔗糖+ 10%豬油+ 1%膽固醇+ 79%標準嚙齒類動物飼料）飼喂4周。在第4周末，小鼠飼喂8 h后，按照100 mg/kg劑量一次性腹腔注射0.25% STZ（pH 4.2，0.l mol/L檸檬酸緩沖液冰浴中新鮮配置）0.2 mL，之后繼續(xù)飼喂高糖高脂飼料1周，測空腹血糖，以血糖值大于11.1 mmol／L為NIDDM建模成功[10-11]。NIDDM小鼠建模成功后，隨機取64只NIDDM小鼠分成4組（每組16只），分別是：正常對照組（NC）、模型對照組（DC）、WRP灌胃組（WT，200 mg/kg）、羅格列酮灌胃組（RT，3 mg/ kg），NC組和DC組給予dH2O，連續(xù)灌胃42 d。42 d后，小鼠斷頭處死后，取腎臟組織，- 80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3小鼠腎組織抗氧化能力及Bax、Bcl-2蛋白表達檢測按試劑盒方法檢測SOD、GPx活性和MDA水平；采用免疫組化SP法測定腎組織中Bax和Bcl-2蛋白表達，試驗同時采用PBS代替一抗作為陰性對照。顯色結(jié)果在高倍鏡下隨機選取20個連續(xù)不重復(fù)的視野，計數(shù)每視野Bax和Bcl-2（棕黃色）陽性細胞的百分率，取其均值表示該因子表達強度。所有操作嚴格按說明書進行。

1.5統(tǒng)計分析

各組試驗數(shù)據(jù)以mean±SD表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料經(jīng)方差齊性檢驗為方差齊性，兩組間差異采用t檢驗；多組資料采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果與分析

2.1茯苓多糖對小鼠腎組織SOD與GPx活性的影響

茯苓多糖對小鼠腎組織SOD與GPx活性的影響見圖1。由圖1可以看出，與NC組比較，WT組小鼠SOD活性無明顯差異（P＞0.05）；與DC組比較，其它各組（NC，WT，RT組）小鼠SOD、GPx活性均明顯升高（P＜0.05）。這表明，WRP能夠增強NIDDM小鼠機體腎臟組織抗氧化酶的活性，有利于自由基的清除。

圖1　茯苓多糖對小鼠腎組織SOD與GPx活性的影響Fig. 1 Effect of WRP on the SOD and GPx levels of the renal tissue in mice

2.2茯苓多糖對小鼠腎組織MDA水平的影響

茯苓多糖對小鼠腎組織MDA水平的影響見圖2。由圖2可以看出，與NC組比較，其它各組小鼠（DC，WT，RT組）MDA水平均明顯升高（P＜0.05）；與DC組比較，其它各組（NC，WT，RT組）小鼠MDA水平均明顯降低（P＜0.05）。這表明，WRP能夠降低NIDDM小鼠機體腎臟脂質(zhì)過氧化，保護自由基介導(dǎo)的氧化損傷。

圖2　茯苓多糖對小鼠腎組織MDA水平的影響Fig. 2　 Effect of WRP on the MDA levels of the renaltissue in mice

2.3茯苓多糖對小鼠腎組織中Bax和Bcl-2表達的影響

茯苓多糖對小鼠腎組織中Bax和Bcl-2表達的影響見圖3與圖4。由圖4可以看出，與DC組比較，WT組和RT組小鼠Bcl-2蛋白量明顯增加，Bax蛋白量明顯降低（P＜0.05）。與DC組比較，其它各組（NC，WT，RT組）小鼠Bax/ Bcl-2比值明顯增加，其中NC組比值最高（P＜0.05）（圖2）。這表明，WRP抑制了NIDDM小鼠Bax蛋白的過多表達。

3　討論

圖3　免疫組化SP法測定小鼠腎組織Bax和Bcl-2表達（×400）Fig. 3 Expression of Bax and Bcl-2 protein in the renal tissues in mice by Immunohistochemical SP method

前期結(jié)果已經(jīng)證實，WRP能有效的降低血糖、血清胰島素、胰高血糖素、TC、TG和LDL-C水平，增加HDL-C水平；并且WRP能提高NIDDM小鼠葡萄糖耐受力，改善糖耐量的異常。這說明，WRP 對NIDDM小鼠具有降糖作用，同時能一定程度上改善糖尿病引起脂代謝紊亂情況。但WRP對DM糖尿病腎病（DN）的作用及其能否作為預(yù)防DN的理想藥物還有待進一步研究。近年來，國內(nèi)外眾多學者對DN發(fā)病機制進行了大量研究，目前主要認為其與遺傳易感性、糖代謝紊亂及由此所致的非酶糖化、多元醇通路激活、PKC激活，脂代謝紊亂、鈣代謝紊亂、高血壓所致腎血流動力學改變、氧化應(yīng)激、細胞凋亡及激肽系統(tǒng)激活有關(guān)。其中，氧化應(yīng)激在DN的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用已被多種研究證實。糖尿病導(dǎo)致的腎臟損傷是通過復(fù)雜交叉的通路，包括糖基終末化產(chǎn)物（AGEs）的形成、蛋白激酶C（PKC）的活化、活性氧自由基（ROS）的生成等。ROS可通過刺激轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、AGEs的過度表達和產(chǎn)生，激活PKC和絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）、介導(dǎo)AGEs激活核轉(zhuǎn)錄因子KB（NF-κB）、PKC-β1以及介導(dǎo)AGES刺激TGF-β1的轉(zhuǎn)錄等作用而參與DN細胞外基質(zhì)（ECM）聚積和發(fā)展。ROS特有的化學活性可以直接氧化損害DNA蛋白脂質(zhì)和碳水化合物，在DN的發(fā)病機制中是關(guān)鍵因素[12]。Calabrese等研究證實，DN小鼠血清環(huán)磷鳥苷（cGMP）增加，GPx減少，腎臟組織MDA和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）水平增加[13]。MDA則常常作為反應(yīng)機體氧化應(yīng)激的一個良好指標，MDA的量可反映機體自由基的含量和脂質(zhì)過氧化程度。SOD是以為唯一底物的酶類清除劑，能夠?qū)⑥D(zhuǎn)化為H2O2或O2，構(gòu)成抗ROS的第一道防線；GPx不但能直接清除ROS反應(yīng)生成的H2O2和LPO，還可以使維生素E、C保持在還原狀態(tài)。因此，SOD、GPx的活力可反映機體抗脂質(zhì)過氧化能力。本研究結(jié)果表明，與模型對照組比較，WT組小鼠腎組織SOD與GPx活性均明顯升高；MDA水平明顯降低；這表明，DM時機體腎組織內(nèi)自由基生成增多，抗氧化防御能力下降，產(chǎn)生了高水平的氧化應(yīng)激；WRP能夠增強機體腎臟的抗氧化性，降低脂質(zhì)過氧化，保護自由基介導(dǎo)的氧化損傷，減輕糖尿病對腎臟的損害。

圖4　小鼠腎組織Bax和Bcl-2表達比較Fig. 4　 Comparison of expression of Bax and Bcl -2 protein in the renal tissue in mice

研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，細胞調(diào)亡機制同樣在DN的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。細胞凋亡是一個由Caspase蛋白激酶家族介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)過程。正常組織中，凋亡去除衰老細胞代之以有絲分裂產(chǎn)生的新生細胞，使組織器官維持正常從而維持自身穩(wěn)態(tài)，而細胞過早過多或過遲過少都與多種疾病的發(fā)生有關(guān)[14]。研究表明，細胞凋亡是導(dǎo)致機體胰島β細胞數(shù)目逐漸減少的主要原因。調(diào)控細胞凋亡的基因有兩類，包括促進基因和抑制基因。Bcl-2基因家族是目前最受重視的調(diào)控細胞凋亡的基因家族，屬于一類新的癌基因家族；Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的兩個重要成員，Bcl-2是抑制凋亡的主要基因，而Bax是促凋亡基因，它們和其家族成員共同構(gòu)成了復(fù)雜的相互作用的網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控細胞凋亡的發(fā)生，兩者比例失調(diào)則導(dǎo)致細胞凋亡[15]。近期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Bcl-2基因的表達對細胞凋亡具有重要作用，其高表達能明顯抑制細胞凋亡、延長細胞壽命，并能對誘導(dǎo)細胞凋亡的各種因素，如自由基、藥物、射線、高溫、強酸、毒素等有較明顯抵抗作用[16]。一般認為，Bcl-2基因抑制細胞凋亡具有多種作用機制。如Can等研究認為Bcl-2基因可能是通過阻止細胞凋亡的早期環(huán)節(jié)發(fā)揮作用的，可阻止或降低細胞皺縮，染色質(zhì)濃縮和DNA裂解的發(fā)生[17]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，Bax雖然自身是促凋亡基因，還能形成同源二聚體誘導(dǎo)細胞凋亡；但其也能調(diào)節(jié)Bcl-2基因的活性，可與Bax形成異源二聚體來抑制細胞凋亡；如果Bcl-2蛋白表達量上升，就會促使Bax的同源二聚體分離而與Bcl-2形成更多的異源二聚體來抑制細胞凋亡。但Bax蛋白單獨并不足以啟動凋亡途徑，Bax蛋白只是作為P53的下游應(yīng)答蛋白，與Bcl-2，P53共同參與調(diào)節(jié)細胞凋亡[18]。Bcl-2和Bax之間的關(guān)系極為密切，Bax/Bcl-2比例越大，說明異源二聚體的形成越多，則抑制細胞凋亡；Bax/Bcl-2比例越小，說明同源二聚體的形成越多，則誘發(fā)細胞凋亡。因此，Bcl-2/Bax比例是抑制細胞凋亡作用最重要因素[19-20]。相關(guān)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，DM大鼠腎小管上皮細胞中由于Bcl-2表達降低，Bax表達增加，進而導(dǎo)致增加細胞凋亡，其原因可能是DM狀態(tài)下的糖脂代謝紊亂改變了Bcl-2與Bax基因的表達[21]。作者結(jié)果表明，與模型對照組比較，WT組小鼠Bcl-2蛋白明顯增加，Bax蛋白量明顯降低。與模型對照組比較，各組小鼠Bax/ Bcl-2比值明顯增加。這表明，WRP抑制了NIDDM小鼠Bax蛋白的過表達，使DM狀態(tài)下腎組織細胞凋亡趨勢受到抑制，能對DN具有一定預(yù)防作用。

4　結(jié)語

WRP對NIDDM小鼠具有降糖作用，同時能一定程度上改善糖尿病引起脂代謝紊亂情況；WRP能使NIDDM小鼠腎組織中SOD、GPx水平明顯升高；MDA的水平明顯降低，增強機體腎臟的抗氧化性，降低脂質(zhì)過氧化，保護自由基介導(dǎo)的氧化損傷，減輕糖尿病對腎臟的損害。WRP能抑制NIDDM小鼠腎組織中bax基因過多表達，使DM狀態(tài)下腎組織細胞凋亡趨勢受到抑制，能對DN具有一定預(yù)防作用。WRP有可能作為一種潛在的抗糖尿病及其微血管并發(fā)癥藥物來發(fā)揮作用，具體機制還有待進一步研究。

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Effect of Pachymaran to the Antioxidant Capacity and Bax, Bcl-2 Protein Expression of Renal Tissue in Mice with Type II Diabetes

HUANG Congliang1，2，ZHENG Jiali1，2，LI Fenglin3，GONG Jingli3
（1. Department of Food and Biological Engineering，Zhangzhou Institute of Technology，Zhangzhou 363000，China；2. Applied Technology Engineering Center of Fujian Provincial University for Deep Processing of Agricultural Products and Safety，Zhangzhou 363000，China；3. Department of Food Engineering，Jilin Agricultural Science And Technology College，Jilin 132101，China）

Abstract：The effect of polysaccharides from Wolfiporia cocos（Schw.）Ryv. & Cilbn（WRP）to the antioxidant capacity and protein Bax，Bcl-2 gene expression of renal tissues in mice with type II diabetes were studied. Non insulin dependent（type II）diabetes mellitus（NIDDM）was induced by the combination of high-carbohydrate/high-fat diet-fed and low dose of streptozotocin（STZ）. Mice were randomly assigned to four treatment groups：the control group，the NIDDM group，the group fed WRP diet and the group fed rosiglitazone diet. The antioxidant capacity and the expression of Bax and Bcl-2 in renal tissues of mice were investigated. The superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GPx）levels in NIDDM mice were increased while the malondialdehydebook=83,ebook=89（MDA）level was decreased after fed with WRP，which indicated that WRP could protect kidney from the damage caused by diabetes by improving the antioxidation activity of kidney，reducing lipid peroxidation and preventing free radical induced oxidative stress. WRP could restrain excessive expression of bax gene in NIDDM mice and inhibit apoptosis of renal cells，which indicated preventive of diabetic nephropathy.

Keywords：polysaccharides from Wolfiporia cocos（Schw.）Ryv. & Cilbn，type II diabetes mellitus，kidney，Bax，Bcl-2

作者簡介：黃聰亮（1976—），男，福建漳州人，副教授，主要從事功能性食品研究。E-mail：huangcoliang@126.com

基金項目：吉林省科技發(fā)展計劃重點支撐項目（20090905）。

收稿日期：2014-08-27

中圖分類號：TS 201.4

文獻標志碼：A

文章編號：1673—1689（2016）01—0082—07