吳志鵬+劉健+趙俊生

摘要：構建雞卵清蛋白啟動子（OV 2.8kb）與含有eGFP基因的慢病毒表達載體，采用實時熒光定量PCR（QPCR）檢測重組慢病毒滴度。將雞卵清蛋白啟動子基因OV連接到慢病毒載體pLVshRNA-eGFP中替換質粒上CMV promoter 元件，經酶切、測序鑒定獲得攜帶OV與eGFP融合基因的重組慢病毒質粒，用QPCR檢測病毒濃度滴定。結果顯示，重組慢病毒質粒pLVshRNA-OV-eGFP酶切鑒定結果與目的基因條帶吻合，克隆測序結果與NCBI收錄的OV基因序列完全一致。在QPCR試驗過程中，發(fā)現(xiàn)空白組和載體組的溶解曲線和擴增曲線較好，證明基因組抽提和QPCR過程無問題。最終測得病毒滴度約為1.6×107 IU/mL。成功構建了攜帶OV與eGFP融合基因的慢病毒表達載體，為進一步研究卵清蛋白啟動子基因的相關功能提供了優(yōu)質的穩(wěn)定轉染載體。

關鍵詞：雞卵清蛋白；慢病毒載體；實時熒光定量PCR；病毒滴度

中圖分類號： S852.65 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0038-02

近年來，通過利用禽類輸卵管制作生物反應器以大規(guī)模生產藥物已成為研究熱點領域[1-2]，而實現(xiàn)外源基因在禽類輸卵管組織中的特異性表達必須有組織特性型的啟動子參與。使用雞卵清蛋白啟動子構建禽輸卵管生物反應器是1種很有前途的策略[3-5]。本研究擬構建卵清蛋白OV與綠色熒光蛋白eGFP融合基因的慢病毒載體，為進一步研究禽輸卵管生物反應器提供試驗基礎[6-7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、菌株及質粒 大腸桿菌宿主菌DH5α來自浙江大學動物科學院動物遺傳育種與繁殖實驗室。HEK-293T細胞，慢病毒表達載體質粒pLVshRNA-eGFP。

1.1.2 主要試劑及藥品 限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、割膠回收試劑盒、Marker 1 kb。血液基因組DNA提取試劑盒、DNA快速純化回收試劑盒、普通質粒提取試劑盒。DNaseⅠ；QPCR mix；BioTek ND5000。雞卵清蛋白啟動子OV和用Primer 5.0軟件自行設計，由英濰捷基（上海）生物公司合成。新鮮雞血20 mL。

1.2 重組慢病毒表達載體的構建與鑒定

1.2.1 雞卵清蛋白啟動子OV基因克隆 用DNA提取試劑盒從新鮮雞血中提取雞基因組DNA[8-9]。用Primer 5.0軟件設計雞卵清蛋白啟動子OV引物，其中在OV引物上游F加上SpeⅠ酶切位點、下游R加上AgeⅠ酶切位點，OV-F：5′-ACACTAGTGTCCTCAGACTTGGC-3′，OV-R：5′-GCACCGGTTGAACTCTGAGTTGTCTAG-3′；用雞基因組DNA做模板，設計OV的PCR反應體系，PCR擴增OV目的片段。用SpeⅠ和AgeⅠ雙酶切OV基因和pLVshRNA-eGFP載體。酶切過后用1%低熔點瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收OV目的片段及線性化pLVshRNA-eGFP載體，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 慢病毒克隆載體pLVshRNA-OV-eGFPP構建鑒定

連接OV目的基因和線性化載體pLVshRNA-ERE-eGFP：OV基因 2 μL、載體pLVshRNA-ERE-eGFP片段 1.5 μL、T4 DNA聚合酶 2 μL、10×ligation buffer 2 μL、ddH2O 12.5 μL （總體積20 μL），16 ℃連接過夜。連接后命名為pLVshRNA-OV-eGFP。重組質粒轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，隨機挑取數(shù)個單菌落，分別搖菌過夜，小提重組質粒DNA。進行SpeⅠ和AgeⅠ雙酶切鑒定，并將最終連接好的pLVshRNA-OV-eGFPP質粒載體送英濰捷基（上海）生物公司測序鑒定。

1.3 QPCR檢測重組慢病毒滴度

1.3.1 病毒感染293T細胞 將狀態(tài)良好的目的細胞接種到6孔板，待細胞長到50%、約1×106個/mL時加50 μL病毒感染細胞[10]。感染開始后20 h，除去培養(yǎng)上清，換為500 μL含DNaseI （TaKaRa Mirus Bio，終濃度為10 U/mL）的新鮮培養(yǎng)基。在37 ℃消化15 min，以除去殘余的質粒DNA。然后換為2 mL正常的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用0.5 mL 0.25%胰酶-EDTA溶液消化細胞，在37 ℃放置1 min。在培養(yǎng)基吹洗下，離心收集細胞[11-13]。

1.3.2 細胞DNA的提取 加入400 μL ACL Solution 和 10 μL Proteinase K。振蕩混勻1 min，然后置于55 ℃水浴 10～20 min，在此期間可以適當取出混勻，有助于充分裂解。取出樣品，待降至室溫時輕輕振蕩混勻。取預處理好的樣品，依次加入 300 μL Ext solution 和 300 μL AB solution，用力搖勻，12 000 r/min 離心5 min。溶液將分層，上層為藍色的抽提層，下層為透明水相，2層溶液中間可能會有部分沉淀層，DNA在下層水相中。將槍頭穿過上層溶液，深入到下層溶液，將下層溶液仔細吸出至 GenClean Column 中，盡量避免吸到上層溶液及中間層的沉淀。8 000 r/min 離心1 min，取下層 GenClean Column倒掉收集管中廢液。將 GenClean Column 放回收集管中，加入 500 μL Wash Solution，8 000 r/min室溫離心1min。取下 GenClean 柱，棄去收集管中的廢液。將柱放回收集管中，12 000 r/min室溫離心1 min，以除去殘留Wash Solution。將柱放入新的潔凈1.5 mL 離心管中，在柱中央加入 50～100 μL ddH2O，室溫或55 ℃放置2 min。然后 12 000 r/min室溫離心1 min。離心管中的液體即為基因組 DNA[14-15]。

1.3.3 Real-time PCR 分析 Real-time PCR 反應體系：2×Real-time PCR Master Mix 10 μL、F/R（序列詳見表1） Primer （10 μmol/L） 0.8 μL、 eachcDNA Template（1 ∶100 dilution）1 μL，ddH2O加至20 μL。

Real-time PCR反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。

2 結果與分析

2.1 雞卵清蛋白啟動子OV片段克隆

用雞基因組DNA做模板，PCR擴增雞卵清蛋白啟動子OV，1%低熔點瓊脂糖凝膠電泳鑒定（圖1）。測序結果證明片段序列與NCBI收錄的OV一致。

2.2 慢病毒克隆載體pLVshRNA-OV-eGFPP構建鑒定及QPCR滴度測定

2.2.1 重組慢病毒質粒的鑒定 重組慢病毒質粒pLVshRNA-OV-eGFP 大小約為10 kb，通過限制性內切酶SpeI和AgeI雙酶切后被切成2個片段：大片段約為7.2 kb，小片段約為2.8 kb。由圖2可知，目的條帶大小基本與預期一致。將陽性重組載體測序，證明外源基因片段成功插入慢病毒載體。

2.2.2 QPCR鑒定重組慢病毒滴度 QPCR分析中從擴增曲線和溶解曲線來看，blank組和vector組的OV幾乎沒有擴增，而過表達組的OV基因有顯著擴增，證明基因組抽提和QPCR過程無問題。在試驗中，細胞數(shù)為2×106個/皿，加病毒 50 μL/皿。根據(jù)慢病毒載體上自帶的WPRE基因和對照組HGB基因的溶解曲線和擴增曲線較好，通過計算軟件測得慢病毒載體滴度約為1.6×107 IU/mL。

3 討論

慢病毒載體是近幾年發(fā)展起來的基因工程載體，其最大的特點是能夠在體內外轉染分裂和非分裂的細胞，是1種具有自我失活功能、無免疫反應的高效基因傳遞工具，具有容納外源目的基因片段大、宿主范圍廣、重組機會低、可將所攜帶的目的基因整合到宿主染色體中并穩(wěn)定長期表達[16]、隨親本的繁殖將外源基因傳遞給子代發(fā)揮作用等優(yōu)點。本試驗中pLVshRNA-eGFP載體是基于HIV1的慢病毒RNA干擾載體，大小為7.8 kb，包含了生產慢病毒所必須的病毒元件、提高病毒滴度、基因表達效率的元件，具有載體結構緊湊、包裝效果穩(wěn)定、病毒滴度高等優(yōu)點，并且pLVshRNA-eGFP載體表達eGFP熒光蛋白，可以方便地觀測病毒感染效率以及用流式熒光分選方法篩選出的陽性細胞。

本研究不僅成功構建鵪鶉輸卵管納豆激酶慢病毒特異表達載體，并且所構建的慢病毒載體將質粒上原來的啟動子CMV片段替換成卵清蛋白啟動子（OV） [17]。而卵清蛋白啟動子是特異性啟動子，感染293T細胞效率低，熒光成像eGFP不表達，不能直接用于病毒滴度測定。使用較少采用的實時熒光定量PCR（QPCR）技術測定慢病毒載體滴度，為進一步利用慢病毒載體構建轉基因鵪鶉奠定基礎，同時也為進一步研究卵清蛋白啟動子基因的相關功能提供了優(yōu)質的穩(wěn)定轉染載體。

參考文獻：

[1]Palmiter R D，Brinster R L，Hammer R E，et al. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes[J]. Nature，1982，300（5893）：611-615.

[2]Clark A J，Burl S，Denning C，et al. Gene targeting in livestock：a preview[J]. Transgenic Research，2000，9（4/5）：263-275.

[3]楊紹清. 雞的基因轉移及用于禽蛋生物反應器基因元件的制備[D]. 北京：中國科學院，1999：119-124.

[4]Love J，Gribbin C，Mather C，et al. Transgenic birds by DNA microinjection[J]. Biotechnology，1994，12（1）：60-63.

[5]Borwompinyo S，Brake J，Mozdziak P E，et al. Culture of chicken embryos in surrogate eggshells[J]. Poultry Science，2005，84（9）：1477-1482.

[6]李海昌. 雞胚的體外培養(yǎng)和轉基因雞的研究[D]. 北京：北京農業(yè)大學，1995：22-24.

[7]劉鳳軍，莊益芬，張文昌. 鵝胚胎體外培養(yǎng)的研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2004（1）：15-17.

[8]Ivarie R. Avian transgenesis：progress towards the promise[J]. Trends in Biotechnology，2003，21（1）：14-19.

[9]Habets G G，Scholtes E H，Zuydgeest D，et al. Identification of an invasion-inducing gene，Tiam-1，that encodes a protein with homology to GDP-GTP exchangers for Rho-like proteins[J]. Cell，1994，77（4）：537-549.

[10]于莉娜，張慶玲，李 新，等. Tiam1基因慢病毒表達載體構建及其在HT29細胞中的表達[J]. 實用醫(yī)學雜志，2010，26（16）：2895-2898.

[11]Lee S H，Kunz J，Lin S H，et al. 16-kDa prolactin inhibits endothelial cell migration by down-regulating the Ras-Tiam1-Rac1-Pak1 signaling pathway[J]. Cancer Research，2007，67（22）：11045-11053.

[12]Valori C F，Ning K，Wyles M，et al. Development and applications of non-HIV-based lentiviral vectors in neurological disorders[J]. Current Gene Therapy，2008，8（6）：406-418.

[13]Shagin D A，Barsova E V，Yanushevich Y G，et al. GFP-like proteins as ubiquitous metazoan superfamily：evolution of functional features and structural complexity[J]. Molecular Biology and Evolution，2004，21（5）：841-850.

[14]王耀輝，王明麗，陳九格，等. 靶向TIPE2基因的shRNA慢病毒載體構建及病毒包裝[J]. 河南大學學報：醫(yī)學版，2014，33（2）：120-122，134.

[15]黃學蘭，徐廣賢，賈 偉，等. 小鼠miRNA-203慢病毒過表達載體的構建及病毒包裝與滴度測定[J]. 寧夏醫(yī)科大學學報，2011，33（7）：605-608.

[16]Nishitsuji H，Ikeda T，Miyoshi H，et al. Expression of small hairpin RNA by lentivirus-based vector confers efficient and stable gene-suppression of HIV-1 on human cells including primary non-dividing cells[J]. Microbes and Infection/Institut Pasteur，2004，6（1）：76-85.

[17]Moffat J，Sabatini D M. Building mammalian signalling pathways with RNAi screens[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology，2006，7（3）：177-187.