趙錦慧+周琳

摘要：對洋蔥進行活化培養(yǎng)，探討鈉離子不同誘導(dǎo)濃度與時間對洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞程序性死亡的影響。結(jié)果表明：隨著鈉離子誘導(dǎo)濃度的升高及誘導(dǎo)時間的延長，細胞形狀和結(jié)構(gòu)均會發(fā)生不同程度的變化，細胞凋亡數(shù)目增加，細胞中丙二醛含量上升，且細胞凋亡率及丙二醛含量在不同處理間均差異顯著。說明鈉離子在一定誘導(dǎo)濃度與時間下，對洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)、細胞凋亡率、丙二醛含量均有不同程度的影響。

關(guān)鍵詞：鈉離子；洋蔥；細胞程序性死亡；細胞凋亡率；丙二醛

中圖分類號： Q942 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0189-02

20世紀90年代初國際上才把細胞程序性死亡（PCD）概念引入到植物學(xué)，隨后有關(guān)研究遍布植物發(fā)育生物學(xué)、植物生理學(xué)等各個領(lǐng)域[1-5]。PCD和細胞凋亡意義相同，均屬于細胞生理性死亡，它貫穿高等植物生長發(fā)育的一生，具有重要的生命意義。

中國每年的農(nóng)作物和瓜果蔬菜都會受到各種逆境因子不同程度的影響，因此對植物的抗逆性機制及調(diào)控進行研究，既有理論意義又有實際應(yīng)用價值。鹽脅迫是植物經(jīng)常遇到的逆境之一，Katsuhara研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫誘導(dǎo)的大麥根部細胞凋亡表現(xiàn)出典型的凋亡特征[6]，揭示了根部細胞凋亡可能是植物抗鹽脅迫的一種生理機制。本試驗選用洋蔥鱗莖內(nèi)表皮作為材料，對鈉離子不同誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)時間下洋蔥細胞程序性死亡現(xiàn)象進行研究，主要觀察凋亡細胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生的變化，并統(tǒng)計細胞凋亡率及測定細胞中丙二醛含量。旨在探索鈉離子不同處理濃度及處理時間誘導(dǎo)洋蔥細胞程序性死亡的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

市售隔年洋蔥。

1.2 試劑

0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L氯化鈉溶液、PBS緩沖液、改良苯酚品紅染液、10%三氯乙酸、0.6%硫代巴比妥酸等。

1.3 試驗方法

1.3.1 洋蔥的預(yù)處理 取隔年洋蔥，室溫下于清水中培養(yǎng) 2～3 d，每天換水，直到露出幼嫩的白根，表明洋蔥已被活化。

1.3.2 細胞程序性死亡觀察 取活化后的洋蔥鱗莖，切取約1 cm2的內(nèi)表皮若干，分成3組進行處理。第1組是正對照，在PBS緩沖液中處理1 h；第2組是鈉離子誘導(dǎo)組，分別用0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L NaCl誘導(dǎo)1、4 h；第3組是負對照，在沸水中處理5 min。各組處理結(jié)束后，將洋蔥鱗莖內(nèi)表皮用改良苯酚品紅染液染色10～15 min，染色完成后制成玻片標本，光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。選擇染色效果好、背景干凈、細胞分散良好的視野進行拍照，并對凋亡細胞進行計數(shù)統(tǒng)計。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/視野中觀察的細胞總數(shù)×100%。每個處理觀察3個玻片標本，細胞凋亡率用3個視野統(tǒng)計的平均值表示。

1.3.3 丙二醛（MDA）含量的測定 參照劉萍等的方法[7]，用硫代巴比妥酸法測定細胞中丙二醛（MDA）含量，測定時設(shè)置3個重復(fù)，最終含量用平均值表示。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用Excel 2003對實驗數(shù)據(jù)進行作圖，運用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，在95%水平上進行One-Way ANOVA分析處理間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照組細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

圖1顯示，正對照組細胞輪廓清晰，細胞之間的界限分明，細胞膜完整無損，細胞質(zhì)透明，背景干凈，細胞核呈球形。負對照組細胞輪廓及細胞之間的界限消失，細胞膜、細胞壁完全裂解，部分細胞核也發(fā)生裂解并且其形狀和位置均發(fā)生一定變化，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)碎末狀物質(zhì)，背景不干凈，細胞不能保持結(jié)構(gòu)的完整。

2.2 不同濃度鈉離子誘導(dǎo)1 h后細胞程序性死亡觀察

圖2顯示，不同濃度Na+誘導(dǎo)1 h后，隨著Na+濃度的增加，細胞輪廓及細胞之間的界限逐漸模糊，質(zhì)壁分離程度加深，形狀及位置發(fā)生變化的細胞核增多，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)的碎末狀或塊狀物質(zhì)越來越多，細胞背景不干凈。

2.3 不同濃度鈉離子誘導(dǎo)4 h后細胞程序性死亡觀察

圖3顯示，不同濃度Na+誘導(dǎo)4 h后，細胞形態(tài)特征發(fā)生了更明顯的變化，部分細胞的細胞膜已經(jīng)破裂，細胞核輪廓模糊，著色變淺，細胞質(zhì)壁分離現(xiàn)象更明顯，細胞質(zhì)內(nèi)塊狀或碎末狀物質(zhì)更多，細胞背景極不干凈。

2.4 不同濃度鈉離子誘導(dǎo)下洋蔥內(nèi)表皮細胞凋亡情況

圖4顯示，隨著Na+誘導(dǎo)濃度的增加及誘導(dǎo)時間的延長，細胞凋亡率呈上升趨勢，并且各處理間差異顯著。這說明不同濃度的Na+誘導(dǎo)不同時間對細胞的生命活動產(chǎn)生了不同程度的影響。

2.5 不同處理下洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞中丙二醛（MDA）含量的變化

MDA是脂質(zhì)過氧化物的代謝產(chǎn)物，其生物活性強，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，它的含量可以間接反映氧自由基對植物細胞的損傷程度。圖5顯示，Na+誘導(dǎo)組丙二醛含量均高于正對照組，并且A3～A9與A1間均表現(xiàn)出顯著差異。同樣誘導(dǎo)濃度下，隨著誘導(dǎo)時間的延長，MDA含量快速增加；同樣誘導(dǎo)時間下，隨著誘導(dǎo)濃度的增加，誘導(dǎo)時間短時MDA含量增加幅度小，誘導(dǎo)時間長時MDA含量增加幅度大。這說明一定濃度的Na+作用一定時間，會對植物細胞造成明顯傷害，并且Na+誘導(dǎo)時間對丙二醛的產(chǎn)生影響更大。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，正對照組細胞輪廓清晰，形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整；負對照組細胞輪廓消失，形態(tài)和結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯變化，細胞不能保持完整；Na+誘導(dǎo)組細胞輪廓發(fā)生變化，細胞質(zhì)壁出現(xiàn)不同程度的分離，細胞核、細胞質(zhì)、細胞膜等細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的變化，Na+誘導(dǎo)濃度和時間與細胞凋亡率及細胞中丙二醛含量成正比。

NaCl之所以能夠誘導(dǎo)細胞程序性死亡，其可能機制是：（1）細胞程序性死亡需要大量的ATP，而線粒體是能不斷產(chǎn)生ATP的一種重要的細胞器，位于線粒體外膜上的受體可以被NaCl刺激，導(dǎo)致膜通透性孔不斷保持開放狀態(tài)，最終使得線粒體的膜通透性增強，使細胞色素C、一些凋亡誘導(dǎo)因子等被釋放，從而加快細胞程序性死亡。（2）Na+濃度升高時，膜質(zhì)過氧化物會在細胞內(nèi)形成，這會破壞細胞膜上鈣離子與鈉離子的相對平衡狀態(tài)，造成細胞膜上的Ca2+被Na+替換掉，從而改變Ca2+的流向，使得Ca2+由細胞內(nèi)向細胞外流動，最終導(dǎo)致細胞膜的透性增強，使細胞內(nèi)的某些凋亡誘導(dǎo)因子等物質(zhì)被釋放，進而加快細胞程序性死亡。（3）Na+濃度越高，細胞發(fā)生質(zhì)壁分離的程度越高， 達到一定程度后會導(dǎo)致細胞內(nèi)液泡裂解，然后液泡中的酸性水解酶等就會被釋放出來，它的釋放可以使細胞內(nèi)的細胞核、高爾基體、核糖體、細胞膜、線粒體等被分解，細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變后誘發(fā)了細胞程序性死亡的發(fā)生[7-9]。

目前對PCD有關(guān)的基因、PCD 的調(diào)節(jié)途徑、各信號分子的調(diào)節(jié)機理以及信號分子之間的關(guān)系等均獲得了一些了解。但是對洋蔥內(nèi)表皮細胞發(fā)生PCD時，相關(guān)酶和蛋白質(zhì)之間是怎樣聯(lián)系并發(fā)揮作用的還有待進一步研究。

參考文獻：

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