黃斌 劉素云 萬麗佳 劉明 吳小秧 羅勤

[摘要]目的 對熒光定量PCR法在人巨細胞病毒感染患兒不同時段尿標本檢測巨細胞病毒中的應用效果進行探討。方法 選取2015年9月～2017年2月我院兒科收治的30例人巨細胞病毒感染患兒，所有患兒分別于清晨采集晨尿作為晨尿組，于其他時段采集尿液標本作為隨機時段組，應用實時熒光定量PCR技術對不同時段尿標本人巨細胞病毒DNA水平進行檢查，對比兩組陽性檢出率。結果 晨尿組，27例檢出人巨細胞病毒陽性，檢出率為90.00%，隨機時段組，20例檢出人巨細胞病毒陽性，檢出率66.67%，晨尿組明顯高于隨機時段組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 對人巨細胞病毒感染患兒應用實時熒光定量PCR技術檢測巨細胞病毒，采集患兒晨尿作為檢測標本，陽性檢出率較高，可有效降低漏診情況，在臨床中值得推廣應用。

[關鍵詞]人巨細胞病毒；小兒；實時熒光定量PCR；不同時段

[中圖分類號] R446.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）4（c）-0119-03

Detection of cytomegalovirus in children with cytomegalovirus infection by urine samples at different time intervals

HUANG Bin LIU Su-yun WAN Li-jia LIU Ming WU Xiao-yang LUO Qin

Department of Pediatrics，People′s Hospital of Pingxiang City，Jiangxi Province，Pingxiang 337000，China

[Abstract]Objective To investigate the effect of fluorescent quantitative PCR in detection of cytomegalovirus （HCMV） in urine samples of children with HCMV infection at different time intervals.Methods A total of 30 cases of infection in our hospital from September 2015 to February 2017 in Department of Pediatrics of infected children，for all children were collected in the morning urine as morning urine group，collecting urine specimens as random specimens from other time periods，the application of real-time fluorescence quantitative PCR technology in different periods of urine HCMV DNA level standard for examination，the positive detection rate was compared between the two groups.Results The results showed that morning urine group，27 cases were detected HCMV positive，the detection rate of 90.00%，random time urine group，20 cases were detected HCMV positive，the detection rate of 66.67%，compared the two groups，morning urine group was significantly higher than that of random time group，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion The detection of HCMV real-time fluorescent quantitative PCR in children with infection of HCMV in children，collection of morning urine samples for testing，the positive rate is high，effectively reduce the misdiagnosis，it is worth in clinical application.

[Key words]Human cytomegalovirus；Children；Real-time quantitative PCR；Different periods

巨細胞病毒感染是由人巨細胞病毒（human cytom-egalovirus，HCMV）引起的人類感染性疾病。HCMV一旦侵入體內，將長期或終身存在體內，在絕大多數免疫正常個體，常成無癥狀感染，但在免疫抑制個體，新生兒及嬰幼兒可出現明顯病癥，表現為肝炎、肺炎、腦膜腦炎、智力低下和先天性耳聾等。HCMV可從宿主尿液、血液及呼吸道分泌物等多個部位排出，國內外已廣泛進行血尿痰等不同標本的檢測[1-2]，尿液標本因其陽性率較高[3]、無創(chuàng)傷，易為患兒及家屬所接受。目前國內外已有晨尿標本檢測HCMV-DNA水平的相關報道[4]，但新生兒及嬰幼兒因其排尿控制較困難，有時需采集其他時段隨機尿標本。本研究通過對不同時段尿應用實時熒光定量PCR技術檢測HCMV-DNA水平，比較晨尿與隨機時段尿的HCMV陽性檢出率，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2015年9月～2017年2月我院兒科收治的30例HCMV感染患兒，其中，男16例，女14例；年齡34 h～1歲，平均（6.5±2.7）個月。所有患兒分別于清晨采集晨尿作為晨尿組，于其他時段采集尿液作為隨機時段組。所有患兒均符合《巨細胞病毒感染診斷方案》中診斷標準，經我院醫(yī)學倫理委員會批準，患兒家屬對本研究知情，且簽署知情同意書。其中下呼吸道感染25例，高膽紅素血癥2例，腸炎3例，部分病例病程較長。

1.2方法

標本采集：晨尿組患兒于清晨6時采集患兒晨尿，隨機時段尿組患兒當天任意時間內采集患兒尿標本。儀器試劑：采用ABI7300型熒光定量PCR儀（美國）檢測HCMV，核酸擴增熒光定量檢測試劑盒（中山大學達安基因股份有限公司）。檢測方法：將采集到的尿液標本輕輕顛倒搖勻，用加樣槍吸出100 μl，取離心管，裝入DNA濃縮液100 μl，將吸出的尿液標本一并加入，振蕩搖勻，在離心機上按12000 r速率離心10 min，將上清液去除，將DNA提取液20 μl加入到剩余的沉淀物中打勻，然后進行瞬時離心數秒，在100℃條件下保溫10 min，再行12000 r速率離心5 min，然后取出2 μl上清液做PCR擴增。

1.3判斷標準

陽性：HCMV-DNA呈典型S型增長曲線，試驗定量結果>500 copies/ml；陰性：不符合陽性判斷標準即為陰性。

1.4統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0分析數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗；計數資料以率表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

通過對不同時段患兒尿采用實時熒光定量PCR技術檢測，結果顯示，晨尿組，陽性檢出率為90.00%，隨機時段組，陽性檢出率為66.67%，兩組比較，晨尿組陽性檢出率明顯高于隨機時段組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。

表1 兩組患兒陽性檢出結果的比較

3討論

HCMV感染是由HCMV引起的人類感染性疾病。我國是HCMV感染的高發(fā)區(qū)，平均感染率高達80%～90%[5]。HCMV一旦侵入體內，將長期或終身存在體內，在絕大多數免疫正常個體，常成無癥狀感染，但在免疫抑制個體，新生兒及嬰幼兒可出現明顯病癥，表現為肝炎、肺炎、腦膜腦炎、智力低下和先天性耳聾等。HCMV可從宿主尿液、血液及呼吸道分泌物等多個部位排出，國內外已廣泛進行血尿痰等不同標本的檢測，尿液標本因其陽性率較高、無創(chuàng)傷，易為患兒及家屬所接受。

HCMV屬雙鏈DNA病毒，僅在人和人間傳播，具有高度的種屬特異性，其生物學特征表現為潛伏-活化，嬰幼兒活動性HCMV感染會造成終末器官病變，以肝炎肺炎等為主要表現形式，在對患兒治療時，及早對小兒HCMV感染準確、快速、便捷的診斷，能為臨床治療提供可靠的依據[6]?，F階段，HCMV感染診斷中，主要依靠實驗室檢查，包含血清特異性抗體檢測、病毒培養(yǎng)、抗原血癥檢測、DNA的PCR檢測、組織病理學檢測及CMV-RNA檢測等。而現階段比較推崇的檢測方法為CMV-DNA定量檢測，通過對熒光信號積累，對PCR進程實時監(jiān)測，從而實現定量分析的目的。而在對不同標本檢測時，標本的采集時間對檢測結果也會帶來較大的影響。

尿液檢查是當前臨床檢查中重要的檢查項目之一，應用范圍非常廣泛，有利于醫(yī)生對疾病進行判斷，掌握患者的病情，并且作為檢測的標本，尿液取材更加方便，PCR定量檢測結果更加準確，在HCMV感染動態(tài)觀察中，以尿液作為檢驗標本應用效果更好[8]。為了使尿檢有效性得到提高，全自動尿沉渣分析儀在尿檢中的應用越來越多，有效提高了尿檢速度的同時，尿檢效率也得到提高。而影響尿檢結果準確性的因素有很多，包含尿液采集時間、檢驗時間及容器污染等因素，都會導致檢驗結果出現差異[9-10]。本研究結果顯示，晨尿組陽性檢出率達到90.00%，而隨機時段組陽性檢出率僅為66.67%，提示尿液標本采集時間段的不同，對檢測結果的影響非常大。之所以選擇晨尿，即清晨起床后空腹狀態(tài)下首次排除的尿液，究其原因，主要是由于人在經過一夜的睡眠后，清晨首次晨尿在人體內會經過濃縮后發(fā)生酸化，在酸性環(huán)境中，尿液內上皮細胞、血細胞及管型等有形成分更為穩(wěn)定；并且清晨尚未進食，尿液成分不會受到飲食的影響，保證了化學成分測定的準確性[11-12]；反之，采集隨機時段尿液標本時，患兒隨時排尿使得體內尿液不會聚集發(fā)生酸化，并且經過運動、飲食等因素的影響，尿液中各種檢測指標也變得分散、稀釋，反映在檢驗結果中，就會出現結果準確性下降的情況，如餐后尿，因此時機體的代謝比較旺盛，腎血流量增大，白細胞邊緣池進入循環(huán)池，病理成分也有所增加[13-14]。所以尿液中的細胞含量相對較高，由于隨機尿不受時間的限制，所以在急診與門診患兒尿液篩查中更為適合，標本也比較新鮮，容易獲取，但所采集的尿液標本只能對一段時間內患者機體的情況進行反映，容易受多種因素的影響，導致病理臨界物質濃度降低，出現漏診情況[15]。也有研究認為，晨尿在膀胱內存留的時間過程，尿液中的葡萄糖及硝酸鹽等成分容易被分解，對在酸性環(huán)境中容易改變的物質不易被檢測出來，所以認為采集清晨第2次晨尿作為尿液標準來檢測更加準確[9]。因此在多種尿檢項目中都要求采集患者晨尿作為標本來檢驗。

綜上所述，對HCMV感染患兒用熒光定量PCR法檢測，不同時段尿液標本對檢測結果會帶來極大的影響，隨機時段尿液標本由于有形成分含量低，因此檢測結果準確性不高；而晨尿因其保留了被檢測成分物質的含量及形態(tài)，所以陽性檢出率更高，檢測結果更準確，在小兒HCMV檢測中應用效果較好，在臨床中有推廣應用的價值。

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（收稿日期：2017-11-07 本文編輯：崔建中）