江露++班秋麗++汪善良

摘要 煙草類胡蘿卜素對(duì)煙葉品質(zhì)和可用性有重要作用，ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）是調(diào)控類胡蘿卜素合成積累的關(guān)鍵酶之一。為研究ZDS基因干擾表達(dá)對(duì)煙草類胡蘿卜素生物合成的影響，從貴州省煙草科學(xué)研究院福泉試驗(yàn)基地取樣品，采用不同株系相同部位的方式取樣，與貴煙1號(hào)（GY1）對(duì)照，篩選出能夠構(gòu)建RNA干擾（RNAi）載體并成功轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株，建立ZDS基因的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的檢測(cè)方法，檢測(cè)新鮮煙葉中ZDS基因表達(dá)水平并分析其遺傳表型的變化。結(jié)果表明，ZDS和其他類胡蘿卜素合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)均下調(diào)，其遺傳后代出現(xiàn)異于正常植株的白化與矮化的表型。證明了ZDS基因?qū)Ξa(chǎn)生這種異同發(fā)揮了作用，也充分佐證了RNAi技術(shù)在基因功能分析中有著重要的作用，但這些樣品表現(xiàn)出白化和矮化的表型是否是由于煙草類胡蘿卜素的合成受到抑制尚不確定，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

關(guān)鍵詞 煙草類胡蘿卜素；ZDS基因；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；RNA干擾

中圖分類號(hào) Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）20-0231-03

Effects on Tobacco Carotenoid Biosynthesis of Expression of ZDS Gene Interference

JIANG Lu BAN Qiu-li WANG Shan-liang

（Guizhou Anweitian Detecting Technology Co.，Ltd.，Guiyang Guizhou 550009）

Abstract Tobacco carotenoids had an important effect on leaf quality and availability.ζ-carotene desaturase（ZDS）was a key enzyme in the regulation of carotenoid biosynthesis.In order to study the interference of ZDS gene expression of carotenoid biosynthesis in tobacco，this paper took samples from Fuquan test base of Guizhou Provincial Academy of Tobacco Science，using different strains of the same parts of the sampling methods，scalding out the transformed transgenic plants of RNA interference（RNAi）vector from tobacco on the 1st（GY1）.ZDS gene SYBR Green I RTFQ RT-PCR test method was built for detecting fresh tobacco leaves ZDS gene expression levels and phenotypic analysis of genetic variation.The results showed that ZDS and other carotenoid synthesis gene expression of key enzymes decreased，and their genetic offspring albino and dwarf phenotype were different from normal plants. It proved that ZDS genes played a key role in those similarities and differences，and it also demonstrated that the RNAi technology played an important role in the analysis of gene function.But it was not sure that the albino and dwarf phenotype of these samples was due to carotenoid synthesis inhibited in tobacco and it needed further validation.

Key words tobacco carotenoid；ZDS gene；RTFQ RT-PCR；RNA interference

植物類胡蘿卜素主要分布在植物葉綠體和有色體膜中，而新鮮煙葉中的類胡蘿卜素主要有葉黃素、新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)和β-胡蘿卜素。類胡蘿卜素作為許多重要的香味成分的前體，在煙味的形成過(guò)程中起著重要的作用[1-4]。高等植物類胡蘿卜素生物合成途徑包括異戊二烯焦磷酸生物合成、八氫番茄紅素生物合成、番茄紅素生物合成、胡蘿卜素生物合成、葉黃素生物合成和蘿卜素裂解等過(guò)程[5]。由圖1可知，異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶（IPP）、牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合成酶（GGPS）、八氫番茄紅素合成酶（PSY）、八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）、ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）、番茄紅素β環(huán)化酶（LCYB）、番茄紅素ε環(huán)化酶（LCYE），其均位于類胡蘿卜素合成途徑中生成α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的基因上游，其中某一個(gè)基因表達(dá)異常并不能說(shuō)明整個(gè)類胡蘿卜素合成代謝途徑異常甚至終止。因此，在研究某一個(gè)基因表達(dá)情況時(shí)，往往需要考慮其他上下游基因表達(dá)的情況。

基因表達(dá)，即DNA到蛋白質(zhì)的過(guò)程。其中，蛋白質(zhì)由mRNA編碼而成，利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR[6-9]對(duì)其進(jìn)行定量分析以獲取其基因表達(dá)水平。而對(duì)于基因表達(dá)調(diào)控，通過(guò)RNA干擾[10-11]（RNAi）載體構(gòu)建人為引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的非正常雙鏈RNA（dsRNA），從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因mRNA降解，達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型，引發(fā)植物RNA沉默，主要有轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（TGS）和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（PTGS）。而PTGS在植物基因研究中有著極其重要的應(yīng)用，比如植物基因功能分析、作物品種改良、抗病蟲和抗逆性等方面[12]。在多種植物如水仙、小麥和草莓中都有ζ-胡蘿卜素脫氫酶基因的相關(guān)研究報(bào)道[13-15]，通過(guò)基因表型變化，鑒定該基因功能，而有關(guān)煙草中ζ-胡蘿卜素脫氫酶基因特性與RNAi引起的基因沉默尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究針對(duì)ZDS基因干擾在煙草類胡蘿卜素中的表達(dá)情況，建立高效可控的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法，準(zhǔn)確定量地檢測(cè)ZDS基因表達(dá)水平，對(duì)研究煙草類胡蘿卜素的生物合成具有重要意義。endprint

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

通過(guò)TaKaRa 公司PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synt-hesis Kit試劑盒提取的煙草cDNA模板，SYBR Premix Dimer Eraser（50×），上下游引物，ROX I，滅菌水，冰塊，量程1 mL、200 μL、100 μL、20 μL、10 μL、2.5 μL的Eppendorf 移液槍及槍頭，ABI公司Stepone，微孔板迷你離心機(jī)，迷你離心機(jī)，一次性醫(yī)用橡膠手套與口罩，記號(hào)筆。

1.2 試驗(yàn)方法

參照煙草基因ZDS全序列[15]和IPP、LCYE、LCYB、內(nèi)參基因Gene21的全序列，用Primer Premier V5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。

使用Stepone時(shí)，設(shè)置RT-PCR反應(yīng)系統(tǒng)為SYBRR Green Reagents，定量方法為Quantitation-Comparative Ct（ΔΔCt），程序運(yùn)行速度為標(biāo)準(zhǔn)Standard，模板類型選擇cDNA。各 cDNA 樣品分別以ZDS、IPP、LCYE、LCYB和 Gene21引物進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix Dimer Eraser（50×）10 μL，上下游引物分別為0.6 μL，ROX I 0.4 μL，cDNA模板1 μL，滅菌水7.4 μL。反應(yīng)程序采用三步法：95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s（收集信號(hào)），72 ℃延伸30 s，40次循環(huán)，溶解曲線條件為95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s（收集信號(hào)）。每個(gè)PCR反應(yīng)重復(fù)2次，并且設(shè)立空白對(duì)照和非轉(zhuǎn)基因GY1的對(duì)照組。在每一循環(huán)的退火階段收集熒光信號(hào)以便進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后得到含有所有標(biāo)本的記錄點(diǎn)曲線。在調(diào)整Baseline cycles和計(jì)算 Threshold value（閾值）后，得出循環(huán)閾值Cycle threshold （即Ct值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)基因表達(dá)的準(zhǔn)確性

樣品在熒光定量 PCR 儀上擴(kuò)增后，得到1條反映核酸擴(kuò)增ZDS基因過(guò)程的S形熒光定量動(dòng)力學(xué)曲線（圖2）。用循環(huán)閾值（Ct）作為臨界點(diǎn)，該點(diǎn)位于PCR產(chǎn)物消除熒光背景后進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期的開始點(diǎn)?？梢钥闯觯瑹晒舛縿?dòng)力學(xué)曲線基線平整，指數(shù)區(qū)斜率較大且比較平滑，擴(kuò)增曲線比較理想。同時(shí)，空白對(duì)照組一直保持水平線，無(wú)引物二聚體產(chǎn)生。

對(duì)于基因表達(dá)的準(zhǔn)確性還必須注意到熒光PCR產(chǎn)物的溶解曲線，用于判斷產(chǎn)物是否相對(duì)專一。溫度升高使雙鏈PCR產(chǎn)物解鏈，以致于不能與熒光染料SYBR Green I分子結(jié)合，熒光信號(hào)減弱。剛開始升溫時(shí)熒光信號(hào)變化不大，當(dāng)溫度接近解鏈溫度時(shí)，信號(hào)變化過(guò)大而出現(xiàn)了峰值。再加熱，雙鏈PCR產(chǎn)物解鏈，所以幾乎是平的，接近解鏈溫度Tm時(shí)，突然變化加大，所以出現(xiàn)峰值。再升溫，產(chǎn)物全部解離，就又是一條直線了。在加熱過(guò)程中出現(xiàn)一些比較矮、寬的峰（圖3），這是由于非特異性產(chǎn)物的影響，因而這一試驗(yàn)數(shù)據(jù)就不能采用。若是陰性對(duì)照GY1出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物，那么這一樣品就不能作為對(duì)照，在Stepone的分析中換成溶解曲線正常的對(duì)照。圖4為熒光PCR產(chǎn)物的溶解曲線，同一引物Tm值較穩(wěn)定，有一些矮但并不寬的峰，非特異性產(chǎn)物不明顯，基因表達(dá)結(jié)果能夠說(shuō)明問(wèn)題。

2.2 檢測(cè)基因表達(dá)的重現(xiàn)性

為了驗(yàn)證該技術(shù)方法的重復(fù)性，以同一個(gè)cDNA樣品為例進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，2次重復(fù)的誤差和變異系數(shù)都較?。ū?）。同時(shí)從圖2的S型熒光定量曲線也可看出，曲線的重復(fù)性和穩(wěn)定性很好，在擴(kuò)增前期，特別是在閾值附近，同一樣品的曲線基本是重疊的，擴(kuò)增后期即進(jìn)入平臺(tái)期后曲線仍比較平穩(wěn)，符合S型。

2.3 ZDS基因干擾表達(dá)對(duì)煙草類胡蘿卜素生物合成的影響

不同樣品對(duì)煙草ZDS基因表達(dá)的影響如圖5所示，其中Gene21為內(nèi)參基因，GY1為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M。誘導(dǎo)ZDS 基因在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)結(jié)果顯示，樣品140-7和140-10對(duì) ZDS基因表達(dá)均明顯下調(diào)，而IPP、LCYE、LCYB也同時(shí)表達(dá)下調(diào)。由圖1 植物煙草類胡蘿卜素的生物合成途徑可知，IPP、ZDS、LCYE、LCYB均為參與煙草類胡蘿卜素生物合成的重要酶之一，其中一個(gè)受到干擾，都會(huì)影響類胡蘿卜素的生物合成。IPP位于ZDS的基因上游，LCYE和LCYB位于ZDS的基因下游，若ZDS基因表達(dá)下調(diào)，那么IPP基因表達(dá)的產(chǎn)物就會(huì)不斷積累，產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)，最終抑制了上游產(chǎn)物異戊烯焦磷酸的合成，而出現(xiàn) IPP基因表達(dá)下調(diào)的情況。此外，ZDS基因表達(dá)受限，導(dǎo)致產(chǎn)物番茄紅素含量下降，而番茄紅素分別在LCYE和LCYB這2種酶的作用下生成α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的這一代謝效率降低，產(chǎn)生正反饋調(diào)節(jié)，最終也抑制了α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素酶的合成，而出現(xiàn)LCYE和LCYB基因表達(dá)下調(diào)的情況。若這種猜測(cè)成立，將更好地解釋分子生物學(xué)中基因沉默的規(guī)律變化。

從圖5還可看出，樣品140-7的基因相對(duì)表達(dá)量較 140-10的相對(duì)表達(dá)量低，說(shuō)明干擾載體對(duì)140-7的ZDS基因的干擾效率較140-10的高。通過(guò)RNAi載體構(gòu)建得到的煙草轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，其種子在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中播種后，與對(duì)照樣品GY1比較，140-7出現(xiàn)大面積的白化和矮化表型，140-10出現(xiàn)部分的白化，矮化暫不明顯（圖6）。由此表明，通過(guò)RNAi這一技術(shù)降低煙草中ZDS基因的表達(dá)后，使得其與正常植株相比表現(xiàn)出了異同，證明ZDS對(duì)產(chǎn)生這種異同發(fā)揮了作用。3 結(jié)論與討論

采用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR展開ZDS基（下轉(zhuǎn)第235頁(yè)）

（上接第233頁(yè)）

因干擾表達(dá)試驗(yàn)，結(jié)果表明，ZDS基因表達(dá)下調(diào)，其他關(guān)鍵酶基因也隨之下調(diào)，說(shuō)明ZDS基因干擾表達(dá)能夠影響煙草類胡蘿卜素的生物合成。通過(guò)RNAi這一技術(shù)使得煙草中ZDS基因的表達(dá)水平降低，出現(xiàn)了異于正常植株的表型變化，證明了ZDS對(duì)產(chǎn)生這種異同發(fā)揮作用。本試驗(yàn)定量檢測(cè)了ZDS基因干擾表達(dá)對(duì)煙草類胡蘿卜素的生物合成的影響，對(duì)闡明煙草類胡蘿卜素中致香前體物合成途徑所需的關(guān)鍵酶基因表達(dá)以及功能具有重要的借鑒作用。endprint

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