陸茵茵，王　超，吳雪銘，黃小英，姚金光，夏　強(qiáng)，馬　韻，龍喜帶，▲

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院

病理科，南寧 530021；3.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，百色 533000；

4.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院肝臟外科，上海 200127)

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論著

POLD3在胃腺癌中的表達(dá)及臨床意義分析

陸茵茵1，2，王超3，吳雪銘3，黃小英3，姚金光3，夏強(qiáng)4，馬韻1,2▲，龍喜帶3，4▲

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院

病理科，南寧 530021；3.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，百色 533000；

4.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院肝臟外科，上海 200127)

【摘要】目的探討DNA聚合酶δ 3(eukaryote DNA polymerase δ 3，POLD3)在胃腺癌(gastric adenocarcinoma，GA)中的表達(dá)情況及臨床意義。方法收集進(jìn)行了根治性切除的GA患者82例，并收集相應(yīng)手術(shù)切除標(biāo)本。通過(guò)免疫組織化學(xué)、蛋白印跡、體外細(xì)胞學(xué)、實(shí)時(shí)定量PCR等技術(shù)檢測(cè)GA組織與細(xì)胞株中POLD3的表達(dá)，分析POLD3表達(dá)對(duì)GA增殖、分化及預(yù)后等的影響。結(jié)果①與腫瘤旁組織相比，POLD3在GA腫瘤組織中的核酸及蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P<0.01)，體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)有類似結(jié)果；②低POLD3表達(dá)水平促進(jìn)腫瘤去分化及增殖；③POLD3表達(dá)水平影響GA患者的預(yù)后，高表達(dá)和低表達(dá)對(duì)應(yīng)的中位總體生存期分別為34個(gè)月和16個(gè)月(P<0.01),低POLD3表達(dá)者其總體死亡風(fēng)險(xiǎn)為高表達(dá)者的2.43倍(95%可信區(qū)間為1.25～4.71)。結(jié)論P(yáng)OLD3在GA腫瘤中表達(dá)下調(diào)，這種下調(diào)與腫瘤的增殖、分化及預(yù)后相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】POLD3；胃腺癌；表達(dá)；臨床意義

在我國(guó)，胃腺癌(gastric adenocarcinoma，GA)是一種常見(jiàn)的嚴(yán)重危害生命健康的惡性腫瘤，是第三位癌癥相關(guān)性致死原因[1]。由于國(guó)內(nèi)大多數(shù)GA患者確診時(shí)病程已處于進(jìn)展期，且多數(shù)合并有局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，故而5年存活率僅為20%左右。因此，尋求早期診斷和判斷預(yù)后的標(biāo)志物依然是該研究領(lǐng)域的重要科學(xué)問(wèn)題[1]。而DNA聚合酶δ 3(DNA polymerase δ 3，POLD3)是一種重要的DNA修復(fù)功能基因，在染色體復(fù)制過(guò)程中扮演重要角色，研究已證明POLD3表達(dá)紊亂影響基因組的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，并參與結(jié)腸癌等腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[2～5]，但POLD3在GA中的表達(dá)及臨床意義如何，至今未見(jiàn)報(bào)道。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象與生存隨訪本研究開(kāi)展前獲得了醫(yī)院倫理委員會(huì)的關(guān)于同意開(kāi)展本研究的相關(guān)倫理審批。研究對(duì)象的入選標(biāo)準(zhǔn)為：病理診斷確認(rèn)的GA患者、TNM分期屬于Ⅰ～Ⅱ期、接受了根治性手術(shù)切除、術(shù)前無(wú)放療與化療史、具有完整臨床病理及生存隨訪資料、知情并同意參與；排除標(biāo)準(zhǔn)為：未經(jīng)病理確診、TNM分期在Ⅲ期以上、未進(jìn)行根治性治療、術(shù)前具有放療與化療史、臨床病理及生存隨訪資料不全者、不同意參與者。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，本研究共入選82例GA患者，所有研究對(duì)象均為2005年1月～2008年12月期間在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院治療的GA患者，其中男58例(70.7%)，女24例(29.3%)，平均年齡(53.17±11.19)歲，有抽煙或酗酒史者分別為58.5%(48/82)和56.1%(46/82)。腫瘤局限于黏膜層與黏膜下層者(即早期胃癌)4例(4.9%)、達(dá)到肌層及以外者(即進(jìn)展期胃癌)78例(95.1%)，這些腫瘤患者中，高分化者占65.9%(54/82)，而低分化或未分化者占34.1%(28/82)。收集所有患者外科手術(shù)切除標(biāo)本(含腫瘤組織與腫瘤旁組織)用于POLD3的免疫組織化學(xué)分析；此外，為分析POLD3的mRNA表達(dá)水平，我們也收集了10例新鮮標(biāo)本。同時(shí)，收集所有研究對(duì)象的相關(guān)臨床病理資料，包括性別、年齡、民族、吸煙史、飲酒史及腫瘤病理特征等。在本研究中，我們定義連續(xù)或累積吸煙6個(gè)月及以上者為陽(yáng)性吸煙者，連續(xù)或累積酗酒3個(gè)月及以上者為陽(yáng)性酗酒者。此外，我們也對(duì)所有病例進(jìn)行了生存隨訪，隨訪截止日期為2014年12月，我們定義總體生存時(shí)間為根治性手術(shù)治療后至患者死亡或至隨訪截止日期仍存活所經(jīng)歷的時(shí)間。

1.2細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)胃腺癌細(xì)胞株(包括高分化癌細(xì)胞株MKN-28和低分化癌細(xì)胞株MKN-45)和非腫瘤胃黏膜細(xì)胞株GES-1均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青鏈素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。

1.3POLD3表達(dá)載體的構(gòu)建采用PCR技術(shù)結(jié)合雙酶切技術(shù)以pcDNA3.0為載體構(gòu)建POLD3表達(dá)載體，具體方法參見(jiàn)我們以前的報(bào)道[6]。

1.4POLD3蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)采用免疫組化SABC法檢測(cè)GA腫瘤組織及腫瘤旁組織中的POLD3蛋白表達(dá)水平，表達(dá)水平通過(guò)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與強(qiáng)度的乘積(即IRS評(píng)分法)確定，更為詳細(xì)的方法與評(píng)分參見(jiàn)我們以前的報(bào)道[7]。在當(dāng)前研究，為便于分析，我們定義IRS≤3分為低POLD3表達(dá)，>3分為高POLD3表達(dá)。POLD3蛋白在細(xì)胞株中的表達(dá)則通過(guò)蛋白印跡法進(jìn)行檢測(cè)，具體方法參見(jiàn)我們以前的報(bào)道[8]。

1.5POLD3核酸表達(dá)水平的檢測(cè)通過(guò)Life公司生產(chǎn)的PureLink?RNA Mini Kit(產(chǎn)品編號(hào)：12183018A)和High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(產(chǎn)品編號(hào)：4368814)來(lái)抽提組織及細(xì)胞總RNA和合成cDNA，使用SYBGreen染料法實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)POLD3 mRNA在組織或細(xì)胞株中的表達(dá)水平，以β-ACT為內(nèi)參，POLD3引物為：5’-GTCTA CGAGA GTGAA TCCTG CACA-3’和5’-GGAAC TCCAA CCAAC ACCAG AA-3’，β-ACT引物為：5’-ATGGA TGATG ATATC GCCGC GC-3’和5’-ATCCA CACGG AGTAC TTGCG CTCA-3’。25 μL PCR反應(yīng)體系含1×UltraSYBR Mixture(產(chǎn)品編號(hào)：CW2601，康維世紀(jì))、200 nM引物，以及約50 ng的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火70 s，重復(fù)50個(gè)循環(huán)。所有樣本定量實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值為最終值，采用2-ΔΔCT進(jìn)行線性化后分析POLD3的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6細(xì)胞增殖分析取1000個(gè)對(duì)數(shù)期細(xì)胞種植于96孔培養(yǎng)板，經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞分裂達(dá)60%培養(yǎng)板面積時(shí)，通過(guò)LipofectamineTM2000按標(biāo)準(zhǔn)流程將POLD3表達(dá)載體、空載或生理鹽水轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，在轉(zhuǎn)染后第1～4天，使用CCK-8增殖檢測(cè)試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)：CK04, DojindoCorp)檢測(cè)分析細(xì)胞的OD250值，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值用于計(jì)算增殖指數(shù)(proliferation index, PI)，增殖指數(shù)按如下公式計(jì)算：PI=OD250Time/OD250Ref，其中OD250Time為檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的OD250值，OD250Reg為轉(zhuǎn)染第一天的OD250值[9]。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間差異采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析來(lái)分析，采用Spearman等級(jí)相關(guān)評(píng)價(jià)POLD3表達(dá)與腫瘤分化的相關(guān)性，通過(guò)Kaplan-Meier法繪制生存曲線與計(jì)算中位生存期(median survival time, MST)，使用多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析與計(jì)算相關(guān)變量的風(fēng)險(xiǎn)值(hazard ratio, HR)和95%的可信區(qū)間，在該模型中，我們采用退步法并結(jié)合Likelihood Ratio檢驗(yàn)法篩選變量是否納入模型，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2結(jié)果

2.1POLD3在GA中表達(dá)下調(diào)免疫組化分析結(jié)果顯示：在GA腫瘤組織中，POLD3蛋白表達(dá)水平比腫瘤旁組織明顯減少(P<0.01，圖1A)，代表性免疫組化染色圖顯示了這種差異(圖1B)，這種差異性的POLD3表達(dá)在mRNA也存在(圖1C)。體外細(xì)胞學(xué)分析亦有類似的發(fā)現(xiàn)(圖1D和E)。

2.2POLD3表達(dá)與GA預(yù)后相關(guān)Kaplan-Meier生存分析表明：與低POLD3表達(dá)者相比，腫瘤組織中高POLD3表達(dá)的GA患者具有更長(zhǎng)的MST，分別為16個(gè)月和34個(gè)月(P<0.01，圖2)；采用多因素Cox回歸模型經(jīng)其他風(fēng)險(xiǎn)因素如腫瘤分型、分期等的校正后，低POLD3表達(dá)者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是高表達(dá)者的2.43倍(95%可信區(qū)間為1.25～4.71)。

2.3POLD3表達(dá)與GA腫瘤分化相關(guān)體外細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果顯示：與高分化的胃癌細(xì)胞株MKN-28相比，低分化的胃癌細(xì)胞株MKN-45其POLD3蛋白與核酸表達(dá)水平均更低(圖1D和E)，提示POLD3表達(dá)水平與GA腫瘤分化程度相關(guān)。GA臨床樣本的Spearman等級(jí)相關(guān)分析進(jìn)一步證實(shí)POLD3表達(dá)水平與腫瘤分化程度呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.331，P=0.01)。

A:POLD3蛋白IRS值的箱圖;B:代表性免疫組織化學(xué)染色圖,左為腫瘤旁組織,右為腫瘤組織;C:新鮮GA組織中POLD3mRNA的表達(dá);D:GA細(xì)胞株中POLD3mRNA的表達(dá);E:GA細(xì)胞株中POLD3蛋白的表達(dá)。圖1 POLD3在GA組織和細(xì)胞株中的表達(dá)情況

圖2 POLD3表達(dá)與GA預(yù)后

2.4POLD3表達(dá)與GA增殖相關(guān)體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明：具有低POLD3表達(dá)的MKN-45細(xì)胞株在POLD3過(guò)表達(dá)的條件下，其增殖能力明顯受到抑制(表1和圖3A)；GA臨床樣本分析也發(fā)現(xiàn)大腫瘤具有更低的POLD3表達(dá)(圖3B)。

表1　POLD3表達(dá)與GA增殖比較

注：表中F值和P值為單因素方差分析結(jié)果。

A:MKN-45細(xì)胞株中POLD3過(guò)表達(dá)對(duì)MKN-45細(xì)胞增殖的影響,圖中條帶為轉(zhuǎn)染1天后蛋白印跡結(jié)果,*和**分別代表P<0.05和0.01;B:GA組織樣本中POLD3表達(dá)與腫瘤直徑的關(guān)系。圖3 POLD3表達(dá)與GA增殖

3討論

GA是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)生機(jī)制的研究進(jìn)展緩慢，可用于早期診斷與判斷預(yù)后的可信標(biāo)志物依然處于艱難的探索中[1，10]。我們當(dāng)前的研究顯示POLD3在GA中表達(dá)紊亂，并影響GA的臨床病理特征如腫瘤分化、增殖等，也許是一種有價(jià)值的研究與治療靶點(diǎn)。

POL δ是DNA聚合酶B族中的重要成員，包含p125、p50、p66和p12四個(gè)亞基；在功能上，主要通過(guò)與增殖細(xì)胞核抗原的相互調(diào)節(jié)作用而涉及DNA錯(cuò)配修復(fù)及堿基切除修復(fù)等過(guò)程[11]。其中p66由POLD3基因編碼，因其充當(dāng)POL δ與增殖細(xì)胞核抗原發(fā)生交互作用的直接功能結(jié)合域，因此，POLD3對(duì)于POL δ是十分必要的，它不僅能提高POL δ與增殖細(xì)胞核抗原的親和力，而且能增加POL δ復(fù)合體的穩(wěn)定性[12]。研究表明：POLD3的表達(dá)紊亂不僅影響機(jī)體DNA錯(cuò)配修復(fù)及堿基切除修復(fù)的能力，而且與一些疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[2～5]。如Dunlop等[3]通過(guò)一個(gè)大樣本病例-對(duì)照研究分析了POLD3的突變體與大腸癌的關(guān)系，結(jié)果顯示POLD3突變體增加大腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但他們并沒(méi)有能分析POLD3在腫瘤組織中的表達(dá)情況及意義。我們的研究結(jié)果顯示，POLD3在GA腫瘤組織中存在表達(dá)紊亂，與非腫瘤組織或細(xì)胞相比，腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞的POLD3核酸與蛋白水平均存在明顯的下調(diào)；體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)與GA臨床樣本分析均證實(shí)這種下調(diào)的POLD3表達(dá)影響腫瘤的增殖及分化，起到了類似癌基因的作用。而且，我們的研究也發(fā)現(xiàn)GA腫瘤組織中的POLD3表達(dá)下調(diào)與GA不良預(yù)后相關(guān)，增加死亡風(fēng)險(xiǎn)約1.4倍，這些結(jié)果提示POLD3表達(dá)紊亂也許涉及了腫瘤如胃癌的演進(jìn)，是一個(gè)有待深入研究的、也許具有重要價(jià)值的潛在腫瘤標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。

總之，我們當(dāng)前的研究提示POLD3在GA中表達(dá)下調(diào)，這種表達(dá)下調(diào)影響GA腫瘤生物學(xué)行為和預(yù)后，涉及GA的演進(jìn)。但是，我們當(dāng)前的研究?jī)H僅包括了82例符合要求的GA樣本，主要為進(jìn)展期GA，也許存在一定的選擇性偏倚；同時(shí)，由于樣本大小的限制，基于臨床病理特征的生存分層分析未能進(jìn)行；盡管對(duì)POLD3表達(dá)紊亂與GA生物學(xué)行為如增殖、分化等進(jìn)行了初步的探討，但并未涉及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等的分析，基于一個(gè)大樣本并結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的研究與分析將有助于增加本研究結(jié)果的可信度與科學(xué)性。

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(編輯：潘明志)

An analysis of POLD3 expression in the gastric adenocarcinoma and its clinical significance

LUYinyin1，2，WANGChao3,WUXueming3,HUANGXiaoying3,YAOJinguang3,XIAQiang4,MAYun1,2▲,LONGXidai3，4▲

(1.DepartmentofPathology,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;2.DepartmentofPathology,CancerHospitalAffiliatedtoGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021,China; 3.DepartmentofPathology,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,China; 4.DepartmentofLiverSurgery,RenjiHospitalAffiliatedtoSchoolofMedicineofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200127,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the expression levels of eukaryote DNA polymerase δ 3(POLD3) in the gastric adenocarcinoma (GA) and its clinical significance. MethodsA total of 82 patients with GA undergoing radical resection were selected and the corresponding surgical resection samples were collected. The expression levels of POLD3 in the tissular samples and cell lines of GA were evaluated by immunohistochemistry, western blotting, in vitro cells analysis and real-time quantitative PCR, etc. Next, influence of POLD3 expression levels on tumor proliferation, differentiation and prognosis of GA was analyzed. Results ①Expression levels of POLD3, including mRNA and protein levels, significantly decreased compared with adjacent tumor tissues(P<0.01), and similar results were also found in the in vitro cytology experiments. ②This down-regulating expression of POLD3 promoted tumor dedifferentiation and proliferation.③The levels of POLD3 expression affected GA prognosis, with 34 months and 16 months of middle overall survival time for high and low POLD3 expression, respectively(P<0.01). Overall risk of death of patients with low POLD3 expression levels was 2.43 times (95% confidence interval 1.25～4.71) higher than that of patients with high POLD3 expression. ConclusionPOLD3 expression is down-regulated in the GA, and this down-regulation may be associated with GA proliferation, differentiation and prognosis.

【Key words】POLD3; GA; expression; clinical significance

(收稿日期：2015-12-22修回日期：2016-02-26)

中圖分類號(hào)：R735.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2016.01.001

作者簡(jiǎn)介：陸茵茵，女，病理學(xué)專業(yè)碩士研究生。E-mail: luyinyin611@qq.com▲通信作者：龍喜帶。E-mail: sjtulongxd@263.net

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81572353，81372639，81160255，81472243，81460423);廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目

(2013GXNSFAA019251，2014GXNSFDA118021，2014GXNSFAA118144，2015GXNSFAA139223)；上海市曙光學(xué)者資助計(jì)劃

(13SG19)

馬韻。E-mail: yunandama@hotmail.com