宋衛(wèi)得，厲雪芹，高堯華，劉培海，劉　冰，盧志曉，孫　燦（日照出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東日照276826）

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高效液相色譜法測定木薯干中黃曲霉毒素B1的不確定度評(píng)定

宋衛(wèi)得，厲雪芹，高堯華，劉培海，劉冰，盧志曉，孫燦
（日照出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東日照276826）

摘要：依據(jù)GB/T18979—2003《食品中黃曲霉毒素的測定》，對(duì)免疫親和層洗凈化高效液相色譜法測定木薯干中黃曲霉毒素B1的不確定度進(jìn)行了評(píng)定。對(duì)檢測過程中產(chǎn)生的不確定分量進(jìn)行了分類，計(jì)算各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，從而計(jì)算出合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度。通過評(píng)估發(fā)現(xiàn)，對(duì)測定不確定度影響最大的分量是檢測方法的回收率，影響最小的分量是樣品質(zhì)量的稱量，合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為10.5 %。

關(guān)鍵詞：液相色譜；黃曲霉毒素；不確定度；木薯干

黃曲霉毒素是黃曲霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中最具威脅的是具致癌性的黃曲霉毒素B1，主要作用于肝臟，產(chǎn)生致癌、致畸、致突變等嚴(yán)重危害[1-4]。目前，世界各國和地區(qū)對(duì)食品中黃曲霉毒素均有明確的限量要求[5]。我國食品安全標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，木薯干中黃曲霉毒素B1的限量為5.0 μg/kg。木薯干作為制造酒精及檸檬酸的重要原料[6]，由于國內(nèi)原料的短缺，釀酒企業(yè)對(duì)木薯干需求量旺盛，進(jìn)口木薯干規(guī)模和數(shù)量巨大，其毒素污染狀況直接關(guān)乎釀酒產(chǎn)品質(zhì)量和釀酒企業(yè)效益。本文以最新的不確定度評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體測定方法，對(duì)高效液相色譜法測定木薯干中黃曲霉毒素B1的不確定度進(jìn)行評(píng)定，為食品和釀酒企業(yè)檢測人員進(jìn)行相關(guān)不確定度評(píng)定提供參考。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

高效液相色譜儀Agilent 1260(熒光檢測器FLD）；黃曲霉毒素免疫親和柱（北京中檢維康公司）；黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司），1.055 μ g/mL，誤差范圍±0.002 μg/mL；甲醇(色譜純)，美國J.T.Baker。

1.2檢測方法

本實(shí)驗(yàn)室測定木薯干中黃曲霉毒素參照GB/T 18979—2003進(jìn)行，并對(duì)某些步驟進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)，檢測結(jié)果滿意。

實(shí)驗(yàn)步驟：稱取25.0 g粉碎樣品，加入5 g NaCl及（8∶2）甲醇-水至100 mL，以均質(zhì)器高速攪拌提取2 min。定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取5.0 mL濾液并加入20 mL水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾。將免疫親和柱連接于20.0 mL注射器下，準(zhǔn)確移取10.0 mL樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以6 mL/min流速通過過免疫親和柱，直至2～3 mL氣體空氣通過柱體。以10 mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并將2～3 mL氣體空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入1.0 mL色譜級(jí)甲醇洗脫，流速為1～2 mL/min，收集全部流出液于玻璃試管中，再加入去離子水定容1 mL淋洗柱，最后用甲醇-水（1∶1）定容至2 mL，待上機(jī)檢測。

1.3不確定度來源

本方法操作步驟相對(duì)復(fù)雜，影響因素多，不確定來源主要包括：（1）樣品制備均勻度引入的不確定度；（2）稱量、定容等引入的不確定度；（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液及配制產(chǎn)生的不確定度；（4）檢測方法回收率引入的不確定度；（5）環(huán)境溫度影響的不確定度。

2　不確定度的評(píng)定

2.1樣品均勻度引入的不確定度

被測試樣品各部位含有黃曲霉毒素的差異較大，本實(shí)驗(yàn)按照標(biāo)準(zhǔn)取樣方法，分別抽取10個(gè)混合樣品進(jìn)行測定，以評(píng)定試樣制備的均勻度。該不確定度評(píng)定屬A類評(píng)定，可由全部10個(gè)不同混合試樣測定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析得出。

本實(shí)驗(yàn)以木薯干中黃曲霉毒素B1為例，將10個(gè)混合樣品分別粉碎、充分搖勻后依次進(jìn)行測定，測試數(shù)據(jù)見表1。

表1 黃曲霉毒素B1的測試數(shù)據(jù)　(μg/kg)

黃曲霉毒素B1含量的平均值：x=4.79 μg/kg。

單次測定∑標(biāo)準(zhǔn)差s(xi)用貝塞爾公式計(jì)算：

樣品分布均勻度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(x)為：

2.2樣品稱量不確定度

2.3樣品定容不確定度

2.3.1由校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V1)

樣品經(jīng)粉碎、提取、凈化后準(zhǔn)確加入1 mL甲醇洗脫，加入去離子水定容至2 mL，使用吸管獲得該體積，依據(jù)JJG196—2006《常用玻璃量具檢定規(guī)程》，2 mL吸管檢定后給出的允許誤差為±0.010 mL，按B類評(píng)定，假設(shè)服從均勻分布，置信因子k=，則由校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V1)為：

2.3.2由溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V2)

實(shí)驗(yàn)室的溫度在20℃±4℃間變化，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，由此引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相比之下，體積由校準(zhǔn)帶來的不確定度分量遠(yuǎn)高于溫度波動(dòng)引入的不確定度分量，因此后者可以忽略。體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(V)=0.0058 mL。

2.4標(biāo)準(zhǔn)品工作液濃度不確定度的評(píng)定

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)品濃度引入的不確定度

本方法采用的標(biāo)準(zhǔn)品1 mL液體試劑，黃曲霉毒素B1濃度為1.055 μg/mL，需經(jīng)2次稀釋配制為標(biāo)準(zhǔn)工作液。標(biāo)準(zhǔn)證書標(biāo)明黃曲霉毒素B1濃度c0為1.055 μg/mL，誤差范圍±0.002 μg/mL，則該標(biāo)準(zhǔn)品濃度不確定度可按B類評(píng)定，同樣按照矩形分布處理，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(c0)為：

2.4.2標(biāo)準(zhǔn)工作液配制引入的不確定度

黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)2次稀釋配制為標(biāo)準(zhǔn)工作液，即將1 mL標(biāo)準(zhǔn)品定容于10 mL容量瓶中，用苯-乙腈（98 ∶2）定容至刻度，充分混勻得到標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確移取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用苯-乙腈（98∶2）定容至刻度，充分混勻得到標(biāo)準(zhǔn)工作液。

即：V1=1 mL，V2=10 mL，V3=1 mL，V4=10 mL。

標(biāo)準(zhǔn)工作使用液的濃度c：

依據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量具檢定規(guī)程》，A級(jí)1 mL吸管，最大允許誤差為：±0.007 mL；A級(jí)10 mL容量瓶，最大允許誤差為：±0.020 mL。按均勻分布處理，由校準(zhǔn)導(dǎo)致的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

由于稀釋操作時(shí)，吸管和容量瓶中的溶液幾乎處于相同的溫度下，因此可以忽略溫度帶來的影響。另外重復(fù)性已包括在樣品均勻度的試驗(yàn)中。

表2 黃曲霉毒素含量檢測的各不確定度分量

2.4.3合成標(biāo)準(zhǔn)樣品工作液配制的不確定度

由此導(dǎo)出標(biāo)準(zhǔn)工作液配制的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(c)為：

2.4.4檢測方法的不確定度

根據(jù)食品理化部分的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范，當(dāng)被測組分含量＜0.1 mg/kg時(shí)，回收率范圍60 %～120 %[7]。經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)室的大量添加回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果證明，當(dāng)添加濃度在0.001～0.01 mg/kg時(shí)，該方法的回收率控制在70 %～105 %范圍之內(nèi)，符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范的要求。因此我們以該數(shù)據(jù)作為評(píng)定該檢測方法不確定度的依據(jù)。該不確定度可包含整個(gè)檢驗(yàn)方法過程中的提取、凈化、淋洗、濃縮、定容及儀器分析等各個(gè)操作步驟在常規(guī)操作下產(chǎn)生的誤差來源。

根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)回收率的上界為a+=105 %，其下界為a-=70 %，其區(qū)間半寬度為a=(a+-a-)/2=(105 %-70 %)/2= 17.5 %，服從均勻分布，置信因子k=。由此引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

大量的回收率數(shù)據(jù)所表征的方法已包括了重復(fù)性引入的不確定度，故不重復(fù)評(píng)定。回收率實(shí)驗(yàn)中，試樣的主要作用是產(chǎn)生一個(gè)與實(shí)際檢測過程相同的載體條件?；厥章蕦?shí)驗(yàn)中沒有包含全部實(shí)驗(yàn)室偏倚分量，對(duì)能夠產(chǎn)生偏倚的量，已在上述不確定度分量評(píng)定中進(jìn)行了單獨(dú)的分析討論。

3　標(biāo)準(zhǔn)不確定度各分量的評(píng)估分析

通過表2中各不確定度分量的大小對(duì)比發(fā)現(xiàn)，不確定度的最大貢獻(xiàn)來自于測試方法的回收率，其次是取樣時(shí)樣品分布均勻度，貢獻(xiàn)最小的是樣品質(zhì)量的稱量，后者在計(jì)算合成不確定度時(shí)可以忽略不計(jì)。

4　合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

5　合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

6　擴(kuò)展不確定度與測試結(jié)果報(bào)告

取包含因子k=2，測試結(jié)果y的擴(kuò)展不確定度：

U=kuc(y)=2×0.50=1.00 μg/kg。

測定結(jié)果報(bào)告為：y=(0.479±1.00)μg/kg，k=2。

7　討論

本研究以木薯干中黃曲霉毒素B1的10次取樣測定數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，進(jìn)行了免疫親和層洗凈化高效液相色譜法測定黃曲霉毒素的不確定度評(píng)定。從中發(fā)現(xiàn)，影響方法不確定度的主要因素是測試方法回收率和樣品分布均勻性。因此，在同等實(shí)驗(yàn)操作條件下，選用性能穩(wěn)定的免疫親和凈化柱和科學(xué)準(zhǔn)確的取樣方法是保證黃曲霉毒素測定結(jié)果準(zhǔn)確性的前提。

一切測試結(jié)果都不可避免地產(chǎn)生不確定度，測試結(jié)果的可靠性取決于不確定度的大小，只有出具不確定度值，檢測結(jié)果才完整而有意義。在本實(shí)例檢測中，黃曲霉毒素B1平均測試結(jié)果為4.79 μg/kg，未超過國標(biāo)限量；但加入擴(kuò)展不確定度值后，黃曲霉毒素B1的濃度已超過國標(biāo)限量值5.0 μg/kg，不能判定為合格，可作為木薯干進(jìn)口企業(yè)應(yīng)對(duì)貿(mào)易糾紛、進(jìn)行維權(quán)的技術(shù)指標(biāo)。

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Evaluation of the Uncertainties in the Determination of Aflatoxins B1in Dry Cassava by HPLC

SONG Weide, LI Xueqin, GAO Yaohua, LIU Peihai, LIU Bing, LU Zhixiao and SUN Can
Rizhao Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau, Rizhao, Shandong 276826, China)

Abstract:The uncertainties in the determination of aflatoxins B1in dry cassava by HPLC according to GB/T 18979-2003 were evaluated. The uncertainty components were classified, the relative standard uncertainty of each component was calculated, and the combined standard uncertainty and expanded uncertainty were calculated eventually. The evaluation results suggested that the component with the maximum uncertainty influence was recovery rate and the component with the minimum uncertainty influence was sample weighing, with the relative combined standard uncertainty of 10.5 %.

Key words:liquid chromatography; aflatoxins; uncertainty ; dry cassava

作者簡介：宋衛(wèi)得(1981-)，男，山東日照人，工程師，碩士，主要從事食品檢驗(yàn)及質(zhì)量控制工作，E-mail：woxinyh2006@163.com。

收稿日期：2015-11-03；修回日期：2015-12-07

基金項(xiàng)目：山東出入境檢驗(yàn)檢疫局科研計(jì)劃項(xiàng)目（SK201619）。

DOI：10.13746/j.njkj.2015415

中圖分類號(hào)：TS261.2；TS261.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）04-0093-03

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-02-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160225.1713.002.html。