劉 燕，朱吉海，孫 偉，趙 珺

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染中單克隆與混克隆干擾基因效率的比較※

劉 燕1，朱吉海2，孫 偉1，趙 珺1

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科)

目的 比較細(xì)胞轉(zhuǎn)染中單克隆與混克隆干擾基因效率。方法 采用胃泌素特異干擾載體轉(zhuǎn)染人胃癌原代細(xì)胞株L25，經(jīng)G418抗性篩選獲得混克隆和單克隆細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR、Western blot和免疫熒光三種方法對(duì)混克隆細(xì)胞和單克隆細(xì)胞干擾胃泌素基因的效率進(jìn)行比較。結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示混克隆細(xì)胞胃泌素mRNA表達(dá)水平被明顯抑制。在挑取的10株單克隆細(xì)胞中，胃泌素的表達(dá)均受到干擾，其效果有差異，其中有2株單克隆細(xì)胞pshRNA-1、pshRNA-10胃泌素mRNA表達(dá)水平抑制率達(dá)到86%，抑制效率與混克隆細(xì)胞相同，其他8株單克隆細(xì)胞的平均抑制率為31%。Western blot和免疫熒光結(jié)果均顯示單克隆細(xì)胞pshRNA-1、pshRNA-10與混克隆細(xì)胞在胃泌素蛋白水平的干擾效果相同。結(jié)論 采用混克隆細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定和后續(xù)基因表達(dá)水平研究，實(shí)驗(yàn)信息量大、周期短、污染幾率小、可重復(fù)性強(qiáng)，是一種省時(shí)、簡(jiǎn)便、高效的方法。

混克隆細(xì)胞 單克隆細(xì)胞 干擾效率

分子克隆實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常需要把外源性的DNA通過(guò)載體導(dǎo)入細(xì)胞，以便進(jìn)行基因功能、基因調(diào)控等方面的實(shí)驗(yàn)[1-3]。這些研究要求外源基因能夠穩(wěn)定整合到宿主染色體的細(xì)胞中，即我們所說(shuō)的克隆化細(xì)胞[4-5]。以往常用的方法是選擇性標(biāo)記，將攜帶外源基因的載體加上neo抗性基因，用含G418的選擇培養(yǎng)基篩選出有效表達(dá)外源基因的單克隆細(xì)胞[6-8]。但這種方法由于實(shí)驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)、不可控因素過(guò)多，往往鑒定不出有效的單克隆。本研究以干擾胃癌原代細(xì)胞株L25中胃泌素基因的表達(dá)為例，構(gòu)建了帶有neo抗性的胃泌素干擾載體(pshRNA-gast)，將其轉(zhuǎn)染入L25細(xì)胞中，經(jīng)G418抗性篩選建立穩(wěn)定整合外源基因的混克隆細(xì)胞株和單克隆細(xì)胞株，應(yīng)用RT-PCR、Western blot和免疫熒光法比較干擾胃泌素表達(dá)的單克隆與混克隆細(xì)胞中靶基因表達(dá)水平的差異，以明確是否有必要通過(guò)獲得單克隆細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

胃泌素干擾質(zhì)粒pshRNA-gast及人胃癌原代細(xì)胞株由實(shí)驗(yàn)室自己構(gòu)建；細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Trizol及LipofectamineTM2000試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR 10×Mix試劑購(gòu)自北京Transgen公司；Gastrin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；二抗購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中(37 ℃，5% CO2)。用0.25%胰酶消化和傳代。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至40%～60%匯合時(shí)轉(zhuǎn)染。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選

1.2.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

混合待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒和脂質(zhì)體稀釋液，吹打混勻，室溫靜置20 min。把混合液逐滴加入待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，邊加邊晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使轉(zhuǎn)染液均勻分布于培養(yǎng)皿。轉(zhuǎn)染細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，除去雙無(wú)培養(yǎng)液，換正常培養(yǎng)液培養(yǎng)。

其后傳代到3～4個(gè)100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h。

1.2.2.2 混克隆篩選

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用0.25%胰酶消化，傳代至60 mm培養(yǎng)皿，使每個(gè)視野細(xì)胞密度在10個(gè)左右，加入含G418(400 μg/mL)的選擇性培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，每日觀察細(xì)胞形態(tài)，3～5 d換液，22 d左右混克隆形成。經(jīng)RT-PCR法鑒定混克隆細(xì)胞中胃泌素的干擾效果。

1.2.2.3 分離單克隆細(xì)胞

用環(huán)套法從混克隆細(xì)胞培養(yǎng)皿中挑取10個(gè)單克隆細(xì)胞，接種至96孔板，用含G418(400 μg/mL)的培養(yǎng)液繼續(xù)篩選培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿96孔板后，傳至24孔板繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，4 w后得到足量的細(xì)胞。

1.3 RT-PCR鑒定胃泌素mRNA水平的干擾效果

分別收集混克隆細(xì)胞和單克隆細(xì)胞，提取細(xì)胞的RNA，用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞胃泌素mRNA的表達(dá)水平。具體方法如下：用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，取4 μg RNA，用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。以1 μL cDNA為模板，以25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。所用引物：Gastrin上游，5′GAC GAG ATG CAG CGA CTA TGT 3′；下游，5′ GGG TCT GCC ACG AGG TGT 3′，擴(kuò)增片段221 bp。β-actin上游，5′CGG GAA ATC GT GCG TGA CAT T 3′，下游：5′CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC 3′，擴(kuò)增片段510 bp。反應(yīng)條件：95 ℃下5 min 1個(gè)循環(huán)；95 ℃下持續(xù)30 s，62 ℃下持續(xù)30 s，72 ℃下持續(xù)30 s，72 ℃下持續(xù)600 s，32個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后用凝膠成像儀照相分析。

1.4 蛋白表達(dá)水平鑒定結(jié)果

1.4.1 Western blot檢測(cè)胃泌素的蛋白表達(dá)水平

收集單克隆細(xì)胞和混克隆細(xì)胞蛋白，進(jìn)行SDS -PAGE電泳(5%濃縮膠，15%分離膠)，濕轉(zhuǎn)法100 V電壓轉(zhuǎn)膜75 min，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉(1 h)。將兔抗人胃泌素抗體(1：800，4 ℃)孵育過(guò)夜；羊抗兔二抗(1：2000)室溫孵育1 h，以 Actin為內(nèi)參照?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒顯色。

1.4.2 免疫熒光法檢測(cè)胃泌素的蛋白表達(dá)水平

接種適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液至圓形玻片培養(yǎng)(37 ℃，5% CO2，24 h)。4%的多聚甲醛固定細(xì)胞(20 min)。將胃泌素多抗( 1：200，4 ℃)過(guò)夜孵育。將FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(1：50 )避光孵育(37 ℃，1 h)。用DAPY(1 μg/mL)襯染細(xì)胞核，抗淬滅劑封片，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察照相。

2 結(jié)果

2.1 成功篩選出混克隆細(xì)胞和單克隆細(xì)胞

人胃癌原代細(xì)胞株轉(zhuǎn)染了胃泌素基因干擾質(zhì)粒后，經(jīng)G418選擇性培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)22 d形成混克隆。在100 mm的培養(yǎng)皿中可見(jiàn)100個(gè)左右的單克隆細(xì)胞，每個(gè)克隆大小約200個(gè)細(xì)胞(圖1)。為了進(jìn)一步獲得單克隆細(xì)胞，應(yīng)用環(huán)套法從混克隆細(xì)胞中挑取10個(gè)單克隆，用G418選擇性培養(yǎng)液繼續(xù)篩選培養(yǎng)30 d，獲得單克隆細(xì)胞。

G418篩選22 d后鏡下可見(jiàn)單個(gè)分散的細(xì)胞克隆，圖示一個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞克隆形態(tài)(a、b×100，c×200)

2.2 胃泌素干擾載體顯著抑制混克隆細(xì)胞和單克隆細(xì)胞中胃泌素mRNA的表達(dá)

收集混克隆細(xì)胞和挑選的10株單克隆細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR法分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)胃泌素的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示混克隆細(xì)胞內(nèi)胃泌素基因的表達(dá)被明顯抑制(圖2A、B)。10株單克隆細(xì)胞中，只有兩株單克隆細(xì)胞胃泌素基因的表達(dá)有較明顯的抑制效果，分別為pshRNA-1和pshRNA-10(圖2C、D)。

A：混克隆細(xì)胞內(nèi)胃泌素mRNA的表達(dá)水平；B：混克隆細(xì)胞胃泌素PCR擴(kuò)增電泳條帶的灰度掃描值；C：篩選的10個(gè)單克隆細(xì)胞內(nèi)胃泌素mRNA的表達(dá)水平；D：?jiǎn)慰寺〖?xì)胞胃泌素PCR擴(kuò)增電泳條帶的灰度掃描值

2.3 胃泌素干擾載體顯著抑制混克隆細(xì)胞和單克隆細(xì)胞中胃泌素蛋白的表達(dá)

應(yīng)用Western blot法分別檢測(cè)混克隆細(xì)胞和單克隆細(xì)胞內(nèi)胃泌素蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，在內(nèi)參照一致的情況下，混克隆細(xì)胞胃泌素的蛋白表達(dá)明顯減弱(圖3A、B)。而兩株mRNA水平干擾效果較好的單克隆細(xì)胞內(nèi)胃泌素的蛋白表達(dá)也被明顯抑制，pshRNA-1細(xì)胞的抑制程度與混克隆細(xì)胞相當(dāng)(圖3C、D)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Western blot的結(jié)果，我們制作了混克隆和單克隆細(xì)胞的爬片，應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)兩種細(xì)胞中胃泌素的干擾效果。如圖所示(圖3E)，在對(duì)照組細(xì)胞的胞漿和胞膜可見(jiàn)強(qiáng)綠色熒光的表達(dá)(FITC染色)，而混克隆細(xì)胞和兩個(gè)單克隆細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的表達(dá)明顯減弱，且減弱程度相當(dāng)。說(shuō)明兩種細(xì)胞內(nèi)胃泌素蛋白均被抑制，與Western Bolt的結(jié)果一致。

A：混克隆細(xì)胞內(nèi)胃泌素蛋白的表達(dá)水平；B：混克隆細(xì)胞胃泌素Wb條帶灰度掃描值；C：?jiǎn)慰寺〖?xì)胞內(nèi)胃泌素蛋白的表達(dá)水平；D：?jiǎn)慰寺〖?xì)胞胃泌素Wb條帶灰度掃描值；E：混克隆和單克隆細(xì)胞內(nèi)胃泌素的表達(dá)水平

3 討論

目前，獲得穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞克隆大多是通過(guò)篩選單克隆細(xì)胞方法[9-10]，但是該過(guò)程非常耗費(fèi)時(shí)間和精力，至少需要一個(gè)月時(shí)間建立轉(zhuǎn)染的混克隆細(xì)胞，再用一個(gè)月時(shí)間從混克隆中分離得到單克隆。由于單克隆沒(méi)有混克隆保存的信息量大，在長(zhǎng)期保存的過(guò)程中丟失信息的幾率也大。而且在單克隆化的過(guò)程中存在不確定因素，經(jīng)常挑選出十幾個(gè)單克隆細(xì)胞，經(jīng)過(guò)一個(gè)多月時(shí)間的單克隆篩選，最后只能得到一兩株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染較成功的細(xì)胞。如本實(shí)驗(yàn)中，挑取的10個(gè)單克隆細(xì)胞經(jīng)鑒定，穩(wěn)定沉默特定基因的細(xì)胞只有2株。篩選22 d得到的混克隆細(xì)胞與歷經(jīng)兩個(gè)月篩選得到的單克隆細(xì)胞對(duì)胃泌素基因的干擾效率基本相同。而篩選混克隆與篩選單克隆比較，具有實(shí)驗(yàn)周期短、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠、細(xì)胞長(zhǎng)期保存較穩(wěn)定等特點(diǎn)，所以對(duì)一些細(xì)胞遺傳背景要求不高的實(shí)驗(yàn)，我們可以直接用混克隆進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，而沒(méi)有必要單克隆化，減少污染機(jī)會(huì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也不受影響。

有人擔(dān)心混克隆細(xì)胞對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)有影響。其實(shí)很多實(shí)驗(yàn)不需要真正的單克隆，只要求細(xì)胞能夠表達(dá)轉(zhuǎn)染的重組質(zhì)粒、達(dá)到表達(dá)或者干擾目的蛋白的目的。即使我們得到的單克隆，在培養(yǎng)數(shù)代后由于細(xì)胞中整合的載體會(huì)脫落下來(lái)，干擾效果也會(huì)逐漸減退，所以單克隆并不一定能夠穩(wěn)定地表達(dá)外源基因。

應(yīng)用混克隆細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，需要優(yōu)化篩選條件以得到高效表達(dá)目的基因的混克隆，包括優(yōu)化抗生素的篩選條件，其中G418篩選的時(shí)間和劑量是至關(guān)重要的。篩選過(guò)程中當(dāng)大量細(xì)胞死亡的同時(shí)有極少數(shù)的細(xì)胞在不斷增殖，此時(shí)不要急于挑取克隆，要繼續(xù)用選擇性培養(yǎng)基篩選，此時(shí)已形成克隆的細(xì)胞還會(huì)有個(gè)別脫落死亡，因?yàn)樵缙跊](méi)有被篩選掉的細(xì)胞DNA可能轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞了，但沒(méi)有整合到宿主的染色體上，又或者DNA整合進(jìn)宿主的染色體了，但整合的位置不穩(wěn)定，這些細(xì)胞只要繼續(xù)篩選會(huì)陸續(xù)死亡。一般等到細(xì)胞不再發(fā)生脫落、克隆長(zhǎng)到足夠大、克隆間即將發(fā)生接觸抑制的時(shí)候才能獲得真正整合了外源DNA的細(xì)胞克隆。

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Comparative study on the efficiency of gene interference between monoclonal and mixed clone cell during cell transfection

LIU Yan1，ZHU Ji-hai2，SUN Wei1，ZHAO Jun1

(1.Department of Immunology，Qinghai University Medical College；2.Department of Cardiothrocic Surgery，the Affiliated hospital of Qinghai University)

Objective To compare the efficiency of gene interference between monoclonal and mixed clone cell during cell transfection.Methods Gastrin specific short/small hairpin RNAs(shRNAs)vector was transfected into L25 cell.RT-PCR，Western blot and immunofluorescence analyses were used for detecting gastrin expression at the mRNA level and protein level in mixed clone and monoclone which obtained by G418 resistence screening.Results The RT-PCR results showed that the most dramatic decrease in gastrin mRNA level was appeared in mixed clone.The gastrin expression level in 10 monoclones were discrepancy.Among the total monoclones，only pshRNA-1 and pshRNA-10 clones showed the significant decrease in gastrin mRNA level，and there interference efficiency was the same as mixed clone.Consistent with this found，Western blot and immunofluorescence analyses showed that in gastrin interference cells，pshRNA-mixed clone，pshRNA-1 and pshRNA-10 monoclones had almost the same gastrin expression efficiency.Conclusion In cell transfection experiments，there are a lot of problems on the selection of monoclones，such as long cycle for screening，the easiness of losing targeted gene in long-term preservation.While，directly using mixed clone for subsequent research give many advantages such as high authenticity of the experiment，being time-saving and less pollution risk，this method is superior to choose monoclones.

Mixed clone cells Monoclonal cells Interference efficiency

※：國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81550043)；青海省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(編號(hào)：2015-ZJ-940Q) 劉燕(1981～)，女，漢族，青海籍，副教授

R730

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.04.009

2016-09-11