何順偉，張耀剛，李超群，彭 源，魏曉星，#

(1.青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院；2.青海大學醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學部，青海 西寧 810016 )

青南高原多房棘球蚴myophilin基因的克隆和序列分析*

何順偉1，張耀剛2，李超群2，彭 源2，魏曉星1，2#

(1.青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院；2.青海大學醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學部，青海 西寧 810016 )

目的 克隆多房棘球絳蟲(Em)的myophilin基因并對其序列進行分析與預測。方法 提取Em原頭節(jié)總RNA，采用RT-PCR技術(shù)擴增myophilin基因，將PCR產(chǎn)物連接入pGM-T載體，轉(zhuǎn)化入DH 5α感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆送測序。采用生物信息學軟件對測序結(jié)果進行序列比對分析，同時預測編碼蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾位點、結(jié)構(gòu)域和抗原表位。結(jié)果 擴增出長度為576 bp的cDNA片段，包含完整開放閱讀框(ORF)，編碼190個氨基酸，與已知細粒棘球絳蟲的序列同源性達99%。預測結(jié)果顯示，編碼蛋白分子式為C935H1519N255O285S11，理論分子質(zhì)量為212 876，PI為8.66。α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲在二級結(jié)構(gòu)中所占的比例分別為51.58%、10.00%和38.42%。含有10個翻譯后修飾位點，各1個Calponin結(jié)構(gòu)域和CH結(jié)構(gòu)域，8個B細胞抗原表位和6個T細胞抗原表位。結(jié)論 成功克隆出Em的myophilin基因并對其進行了有效分析和預測。

多房棘球蚴 親肌肉抗原 基因 克隆 序列 分析

細粒棘球絳蟲(Echinococcosis granulosa，Eg)和多房棘球絳蟲(Echinococcus multilocularis，Em)的幼蟲感染機體可分別引發(fā)囊型包蟲病(Cystic echinococcosis，CE)和泡型包蟲病(Alveolar echinococcosis，AE)，是我國西北畜牧地區(qū)流行的人畜共患寄生蟲病。近年來，免疫診斷和疫苗預防研究是包蟲病防控研究的重點[1]。而尋找靈敏特異的抗原是包蟲病免疫診斷和疫苗預防的基礎(chǔ)和前提[2]。

研究發(fā)現(xiàn)，親肌肉蛋白(myophilin)為棘球絳蟲的一種具有特異免疫原性的天然抗原，在CE的免疫研究中已取得良好的效果[3-5]，而目前在AE中的研究較少。因此，本研究擬從Em原頭節(jié)中克隆出myophilin基因，分析其基因序列，預測編碼蛋白屬性，為進一步研究myophilin蛋白的免疫保護作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料選擇

Em原頭節(jié)來自青海西寧地區(qū)經(jīng)Em感染的小鼠。TRIzol?LS Reagent購自上海索萊寶公司；TIANScript RT Kit、2×Taq PCR MasterMix、GeneGreen核酸染料、D2000 DNA Marker、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pGM-T連接試劑盒、DH 5α感受態(tài)細胞均購自北京天根公司。引物由上海生工公司合成，其中上游引物為5′-ATGGATCCATGTCGAACGTTCCACCTCC-3′，下游引物為5′-GCCTCGAGAATCTAATCCATGATCATGC-3′(下劃線為BamHI/Xhol酶切位點)。

1.2 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

按TRIzol?LS Reagent的操作說明提取原頭節(jié)總RNA，隨后反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，置-20 ℃冰箱保存。

1.3 myophilin基因的擴增與測序

PCR擴增反應體系：cDNA 1 μL，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，上、下游引物各1 μL，補水至20 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將目的片段切膠回收，連接入pGM-T載體，轉(zhuǎn)化入E.coli DH 5α感受態(tài)細胞，涂布于培養(yǎng)皿上過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆測序(上海生工公司)。

1.4 myophilin基因序列分析

利用BLAST軟件(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將測序結(jié)果同已報道的Eg的myophilin核苷酸和氨基酸序列進行比對分析。

1.5 myophilin蛋白預測

1.5.1 理化性質(zhì)預測

使用ProtParam軟件(http：//expasy.org/tools/protparam.html)推算蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)。

1.5.2 二、三級結(jié)構(gòu)預測

使用GOR4軟件(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。使用SWISS-MODEL服務器(https：//swissmodel.expasy.org/)模擬蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。

1.5.3 翻譯后修飾位點和結(jié)構(gòu)域預測

使用MotifScan軟件(http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)預測酰胺化、糖基化等翻譯后修飾位點和結(jié)構(gòu)域。

1.5.4 抗原表位預測

使用DNAstar軟件的Protean模塊中不同分析方法預測蛋白抗原表位。選用Hopp-Woods親水性、Emini表面可及性、Karplus-Schulz柔性、Jameson-wolf抗原性指數(shù)4種參數(shù)綜合預測B細胞抗原表位。選用AMPHI和Rothbard-Taylor兩種方法聯(lián)合預測T細胞抗原表位。

2 結(jié)果

2.1 myophilin基因的擴增與測序

采用RT-PCR技術(shù)從Em原頭節(jié)中擴增出約576 bp的目的條帶(圖1)。

2.2 基因序列分析

經(jīng)測序后共得到576 bp的cDNA序列(圖2)。Blast比對顯示，該序列包含573 bp的開放閱讀框，編碼190個氨基酸。與Eg的myophilin核苷酸序列(GenBank：Z29075.1)和氨基酸序列(GenBank：CAA82316.1)同源性均為99%。編碼區(qū)有6個堿基不同，分別是54位的C-T、123位的A-G、287位的T-G、324位的T-C、351位T-C和528位的T-C；一處氨基酸有差異，為第96位的V-G(纈氨酸-甘氨酸)。

M：DNA標志物(D2000)；1：目的基因，2：陰性對照

圖2 myophilin基因的測序結(jié)果圖

圖3 二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果圖

2.3 蛋白預測

2.3.1 理化性質(zhì)

經(jīng)Protparam在線預測，myophilin蛋白Lys含量最多(10.5%)，His和Trp含量最少(0.5%)，理論分子量為212 876，pI為8.66，酸性氨基酸(D，E)為24個，堿性氨基酸(K，R)為27個。原子組成為C935H1519N255O285S11，不穩(wěn)定指數(shù)為31.97，半衰期為30 h(mammalian reticulocytes，in vito)。脂肪族氨基酸指數(shù)為82.11，總平均親水性為-0.473。

2.3.2 二、三級結(jié)構(gòu)

GOR4軟件預測結(jié)果顯示(圖3)，α-螺旋占氨基酸總數(shù)的51.58%，β-折疊占10.00%，無規(guī)則卷曲占38.42%。運用SWISS-MODEL軟件模擬蛋白的3D構(gòu)象(圖4)，該模型主要由4個α螺旋和1個β折疊以及多個無規(guī)則卷曲組成。

圖4 三級結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果圖

2.3.3 翻譯后修飾位點和結(jié)構(gòu)域

MotifScan特定位點分析結(jié)果顯示，myophilin蛋白可能存在以下翻譯后修飾位點：1處酰胺化位點(19-22位氨基酸)，2處N-糖基化位點(76-79、86-89位氨基酸)，1處酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位點(132-135位氨基酸)，4處N-肉豆蔻酰位點(55-60、98-103、170-175、179-184位氨基酸)，2處蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點(64-66、171-173位氨基酸)?？赡艽嬖?處典型的蛋白結(jié)構(gòu)域：1處鈣調(diào)理蛋白結(jié)構(gòu)域(Calponin)，位于165-189位氨基酸和1處鈣調(diào)理蛋白同源結(jié)構(gòu)域(CH)，位于25-131位氨基酸。

2.3.4 抗原表位

用DNAstar軟件分析各項指標結(jié)果(圖5，表1)。結(jié)合Hopp-Woods親水性、Emini表面可及性、Karplus-Schulz柔性和Jameson-wolf抗原性指數(shù)4種參數(shù)中分值較高的表位區(qū)域，預測出8個B細胞抗原表位，分別為15-29、41-48、72-77、110-115、130-136、145-161、169-177和181-188位氨基酸。結(jié)合AMPHI和Rothbard-Taylor兩種分析結(jié)果預測出6個T細胞抗原表位，分別為46-53、59-75、82-96、100-108、117-123和155-163位氨基酸。

圖5 DNAstar分析結(jié)果圖

表1 不同分析方法所得預測結(jié)果

3 討論

Myophilin基因編碼區(qū)全長573 bp，編碼190個氨基酸。Martin等[3]最早從Eg中克隆和鑒定出myophilin基因，因其編碼蛋白特殊的分布位置及與其他肌肉蛋白高度同源故稱之為親肌肉基因。隨后，他們克隆了397 bp Em的部分myophilin cDNA序列[6]。張靜等[7]首次克隆了我國大陸株Eg的myophilin基因，序列與Martin等報道的相一致。本研究從青南高原Em原頭節(jié)中成功擴增出了myophilin基因完整的開放閱讀框，將測序結(jié)果與Eg的參考序列比對發(fā)現(xiàn)二者相似度達99%，僅有6個堿基和1個氨基酸不同，而與前述報道Em的myophilin序列相一致。

氨基酸的排列順序決定了蛋白質(zhì)的特殊功能和高級結(jié)構(gòu)，蛋白的生物活性和天然構(gòu)象很大程度上依賴于其氨基酸的編碼區(qū)序列。隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展和廣泛應用，使用生物信息學軟件分析和預測蛋白氨基酸序列，操作簡便、迅速，不僅可以清楚地了解蛋白的基本性質(zhì)，而且還可直觀地得到該蛋白的特殊結(jié)構(gòu)。本研究選用相應的在線網(wǎng)絡軟件對Em的myophilin蛋白的理化性質(zhì)和二、三級結(jié)構(gòu)進行預測。推測該蛋白理論分子質(zhì)量為212 876，等電點為8.66，這與同源的Eg myophilin蛋白的研究結(jié)果相一致。預測的α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲在二級結(jié)構(gòu)中所占的比例分別為51.58%、10.00%和38.42%，由于α-螺旋和β-折疊有利于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，無規(guī)則卷曲處有利于形成抗原表位，因此myophilin蛋白具有良好的穩(wěn)定性和較強的抗原性。通過對三維結(jié)構(gòu)的模擬，可以加深我們對其線性和空間結(jié)構(gòu)的了解。

甲基化、糖基化等常見的翻譯后修飾是蛋白質(zhì)成熟的必要程序，對蛋白的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要[8]。Martin等[6]對Eg中myophilin蛋白的亞型和PKC磷酸化研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白與鈣結(jié)合蛋白不僅氨基酸序列高度同源，而且在組織定位、蛋白亞型、體外PKC磷酸化、相對保守區(qū)域等方面都十分相似，因此認為myophilin蛋白很可能參與平滑肌收縮，與棘球絳蟲的肌肉運動有關(guān)。他們采用生物化學的方法體外證實myophilin蛋白含有兩個PKC位點(Ser-64、Ser-171)。同時通過二維蛋白電泳分離Eg幼蟲體內(nèi)的蛋白，獲得了4種myophilin蛋白亞型(α、β、γ、δ)，推測這些亞型可能為翻譯后修飾的結(jié)果。本研究預測myophilin蛋白可能含有10個翻譯后修飾位點和2個典型的蛋白結(jié)構(gòu)域，這同上述Eg中myophilin蛋白的生物學功能研究相一致。

Myophilin蛋白是一種保護性抗原。多項研究表明[9～11]，使用myophilin重組蛋白免疫小鼠，可使小鼠獲得較高的免疫保護力。此外，在旋毛蟲[12]、日本血吸蟲[13]和華支睪吸蟲[14]等蟲體中已相繼發(fā)現(xiàn)親肌肉蛋白或類似蛋白，并且實驗證實這些蛋白都是特異性肌肉抗原。因此，myophilin蛋白是一個極具應用潛能的診斷和疫苗候選分子。目前，信息學技術(shù)已逐漸成為蛋白抗原表位篩選的重要工具，為判斷蛋白是否具有疫苗分子潛力或者怎樣設計才能具有更好的免疫效果提供了便利條件。本研究使用DNAstar軟件中多個參數(shù)對myophilin蛋白的B、T細胞抗原表位進行預測與分析，共評估出8個B細胞抗原表位和6個T細胞抗原表位，為后續(xù)保護性抗原表位的篩選提供參考。但myophilin蛋白能否作為Em有效抗原的基本條件和誘導宿主產(chǎn)生特異性免疫應答，仍需要進一步實驗證實。

本研究對Em的myophilin基因進行了分析研究，從分子水平了解了Em的生理代謝、致病機制和生物學功能，為后續(xù)基于myophilin蛋白的包蟲病免疫診斷和疫苗研發(fā)提供了理論依據(jù)。

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Cloning and sequence analysis of the myophilin gene in Echinococcus multilocularis from Southern Qinghai Plateau

HE Shun-wei，ZHANG Yao-gang，LI Chao-qun，PENG Yuan，WEI Xiao-xing*

(1.Department of Ecologically-environment Engineering，Qinghai University；2.Department of Medical College，Qinghai University，Qinghai 810016，China)

Objective Cloning the myophilin gene in Echinococcus multilocularis，analysis and forecast of its sequence.Methods Total RNA was exacted from the protoscoleces of Em and the myophilin gene was cloned by reverse transcription RCR(RT-PCR).The PCR products were connected into the pGM-T vectors and then transformed into DH 5α competent cells.Positive clone was sequenced.Bioinformatics softwares were used to analysis the sequencing results and predict the physical and chemical properties，secondary structure，tertiary structure，post-translated modification sites，domains and antigen epitopes of the encoded protein.Results The 576 bp cDNA fragment was cloned，containing the complete open reading frame(ORF)and encoding 190 amino acids.The homology was up to 99% with the known sequence of Eg.Prediction results showed that the molecular formula of the encoded protein was C935H1519N255O285S11.Its theoretical molecular weight was 212876 and isoelectric point was 8.66.Alpha helix，β-sheet，and random coil accounted for 51.58%，10.00% and 38.42% in the secondary structure，respectively.There were 10 post-translated modification sites，a calponin domain，a CH domain，8 potentail B cell antigen epitopes and 6 potential T cell antigen epitopes in the myophilin protein.Conclusions The myophilin gene was cloned from Em successfully，and effective analysised and predicted.

Echinococcus multilocularis Myophilin Gene Cloning Sequence Analysis

*青海省科技廳項目(N0.2016-ZJ-746)；#：通訊作者，碩士生導師，Email：weixiaoxing@tsinghua.org.cn

R383.3

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.04.002

2016-09-25

何順偉(1988～)，女，漢族，河南籍，在讀碩士研究生