李海萍，高博文

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤婦科；2.武警后勤學(xué)院)

核酸實時熒光PCR法檢測高危HPV(16和18型分型)聯(lián)合TCT檢查應(yīng)用于宮頸癌篩查的價值分析※

李海萍1，高博文2

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤婦科；2.武警后勤學(xué)院)

目的 分析核酸實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測高危HPV(16和18型分型)(PCR12+2)聯(lián)合TCT檢查應(yīng)用于宮頸癌臨床篩查中的價值。方法 將進行宮頸癌篩查的480例受檢對象行宮頸脫落細(xì)胞的薄層液基細(xì)胞學(xué)(TCT)、核酸實時熒光PCR檢測的同時，對HPV16和HPV18進行分型檢測(PCR12+2)、陰道鏡活檢及組織病理學(xué)檢查。對檢測結(jié)果分組(TCT組、PCR12+2組、TCT聯(lián)合PCR12+2)評價、分析。結(jié)果 三組患者病理學(xué)檢查≥宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ級(CIN II)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3．35，P>0.05)；TCT組陽性率為59.09%，PCR組為64.0%，聯(lián)合組檢測陽性率為94.44%，聯(lián)合檢測的陽性率明顯高于單獨對HPV16和HPV18進行分型檢測的結(jié)果，差異具有顯著性(P<0.05)。結(jié)論 聯(lián)合核酸實時熒光PCR方法檢測高危HPV(16和18型分型)(PCR12+2)與TCT聯(lián)合檢查應(yīng)用于宮頸癌臨床篩查的陽性診斷率高，具有更好的準(zhǔn)確性。

核酸實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法 HPV 液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查 宮頸癌

美國已將宮頸細(xì)胞HPV檢測作為宮頸細(xì)胞學(xué)檢查的輔助手段用于宮頸癌初級篩查。國際癌癥研究中心則認(rèn)為，可以將HPV檢測作為獨立的宮頸癌初級篩查的選擇之一[1]。有研究顯示，有15種HR-HPV感染與宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)，50%以上的宮頸癌是由HPV16感染導(dǎo)致，10%～15%的宮頸癌是由HPV18導(dǎo)致[2]。當(dāng)前臨床中應(yīng)用宮頸癌篩查的方法主要有宮頸涂片檢查、液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查等，對于患者疾病的診斷和治療具有重要意義。為探討HPV16和HPV18分型檢測在宮頸癌前病變和宮頸癌篩查中的臨床價值，本研究通過分組對照研究探討單獨液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查、實時熒光PCR同時對HPV16和HPV18進行分型檢測(PCR12+2)，以及聯(lián)合兩種檢測方式的陽性率，明確核酸實時熒光PCR法檢測高危HPV(16和18型分型)聯(lián)合TCT檢查應(yīng)用于宮頸癌篩查的分析價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2013年1月～2015年12月之間來我院進行宮頸癌篩查的480例受檢對象作為研究資料，年齡20～55歲，平均(39±12)歲。所有患者均出現(xiàn)程度不一的外陰瘙癢、白帶異常、性交出血、間歇性陰道出血等臨床癥狀。對觀察對象行TCT檢測、PCR12+2檢測和陰道鏡活檢及組織病理學(xué)檢查。

1.2 倫理和知情同意

所有觀察對象均知情同意，項目通過醫(yī)療倫理委員會審查。

1.3 方法

所有組患者給予TCT檢測，采用美國TriPath公司生產(chǎn)的AutoCyte Prep型自動制片染色機系列制片，由具備細(xì)胞學(xué)診斷資質(zhì)的專業(yè)病理醫(yī)師負(fù)責(zé)細(xì)胞學(xué)診斷。細(xì)胞學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2001年國際癌癥協(xié)會的The Bethesda system(TBS)系統(tǒng)[3]。具體方法：使用特制塑料毛刷收集受檢對象宮頸外部鱗狀上皮與柱狀上皮交接位置宮頸管的脫落細(xì)胞，然后將組織標(biāo)本放入到振蕩器震蕩10 min；然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到裝有保存液的保存瓶中，在離心機上進行離心處理，隨后將上層清液倒掉；使用稀釋液對底部收集得到的細(xì)胞團進行稀釋，達到合適的比例之后再次使用振蕩器進行均勻處理。放入到自動制片機進行高速打散處理，隨后吸附到膜管中，最終印制在玻片上，得到直徑為2 cm、細(xì)胞數(shù)在2萬個左右的玻片；等待涂片自然干之后使用濃度為95%的酒精進行固定處理，時間為15 min，隨后選擇應(yīng)用巴氏法進行染色。

所有組患者給予核酸實時熒光PCR檢測，采用廣東凱普生物有限公司生產(chǎn)的HR—HPV核酸檢測試劑盒檢測HR、HPV，同時對HPV16和HPV18進行分型檢測，可在同一反應(yīng)管中通過儀器的4種熒光檢測通道分別檢測：(1)不分型12種HR．HPV(31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68)；(2)HPV16；(3)HPV18。

所有患者行陰道鏡活檢及組織病理學(xué)檢查。在陰道鏡下對醋酸上皮和碘試驗不著色區(qū)進行多點活檢，正常轉(zhuǎn)化區(qū)則取3、6、9、12點活檢。

1.4 患者的觀察指標(biāo)

對所有患者行不典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS)、高度病變鱗狀上皮細(xì)胞(HSIL)、低度病變鱗狀上皮細(xì)胞(LSIL)以及組織學(xué)檢查，根據(jù)TBS分類法對結(jié)果進行評價。檢查結(jié)果為ASCUS、HSIL或者LSIL、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、CA時認(rèn)定為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究中的相關(guān)數(shù)據(jù)均錄入到SPSS18.0軟件實施數(shù)據(jù)處理，三組患者的檢測結(jié)果采用百分比(%)的形式表現(xiàn)，以組織病理學(xué)檢查結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，計算三組篩查宮頸癌及癌前病變的敏感度、特異度及陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。組間比較采用確切概率法，檢驗比較采用卡方檢驗。以P<0.05代表差異結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCT與組織病理學(xué)檢查結(jié)果的關(guān)系

480份標(biāo)本經(jīng)TCT檢測，陽性結(jié)果經(jīng)陰道鏡和宮頸組織病理學(xué)檢查，以病變程度≥CINⅡ為陽性，病變程度ASCUS為陽性病例，TCT≤ASCUS為陰性病例。在TCT檢測為正?；蜓装Y患者中有7例陽性患者，陽性率為16.3%；ASCUS患者中共5例，陽性率為11.6%；LSIL患者中共3例，陽性率為7.0%；HSIL患者中共7例，陽性率為16.3%；ASC-H患者中有12例患者，陽性率為27.9%；AGC患者中共9例，陽性率為20.9%。見表1。

表1 TCT檢測與組織病理學(xué)檢查結(jié)果的關(guān)系表 例(%)

CIN：宮頸上皮內(nèi)瘤變；CA：宮頸癌.

表2 TCT檢測與組織病理學(xué)檢測方法的比較結(jié)果

TCT檢測陰性患者中有12例宮頸癌癥患者，373例非癌患者；在TCT陽性患者中有31例宮頸癌癥患者，64例非癌患者，經(jīng)卡方檢驗，χ2為81.38，P為0.00，可見TCT檢測與病理學(xué)檢測結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異。經(jīng)過組織病理學(xué)檢測證實，TCT檢測的敏感性為72.1%，特異性為85.4%，陽性預(yù)測值為32.6%，陰性預(yù)測值為96.9%。見表2。

2.2 PCR12+2與組織病理學(xué)檢查結(jié)果的關(guān)系

480例經(jīng)過PCR12+2法檢測，在43例確診為≥CINⅡ者中，確定HPV16陽性共19例，陽性率為44.2%；確定HPV18陽性有8例，陽性率為18.6%；確定其他HR-HPV陽性共6例，陽性率為14.0%；HR-HPV陰性患者共10例，陽性率為23.3%。見表3。

表3 PCR12+2檢測與組織病理學(xué)檢查結(jié)果關(guān)系表例(%)

a：有2例為HPV16、HPV18陽性者，經(jīng)過病理證實為炎癥，此例分別計人HPV16(+)、HPV18(+).

PCR檢測的陽性患者中宮頸癌患者33例，陰性患者中有癌患者10例，經(jīng)卡方檢驗得知，χ2為60.97，P為0.00，可以認(rèn)為PCR檢測結(jié)果與病理學(xué)檢查有統(tǒng)計學(xué)差異。經(jīng)過組織病理學(xué)檢測證實，PCR12+2作為診斷宮頸癌及其癌前病變篩查的的敏感性為76.7%，特異性為78.4%，陽性預(yù)測值為25.8%，陰性預(yù)測值為97.2%。見表4。

表4 PCR12+2檢測與組織病理學(xué)檢測方法的比較表

2.3 TCT聯(lián)合PCR12+2檢測與組織病理學(xué)檢查結(jié)果的關(guān)系

在病理學(xué)檢查確診的43例患者中，聯(lián)合檢測方法確診出40人，437例非宮頸癌患者中聯(lián)合檢測顯示陰性的人群有334例，經(jīng)過卡方檢驗，χ2為90.28，P為0.00，可以認(rèn)為聯(lián)合檢測與病理學(xué)檢查的檢測結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異。聯(lián)合檢測的敏感性為93.0%，特異性為76.9%；陽性預(yù)測值為28.0%，陰性預(yù)測值為99.1%，可見該篩選方法用于區(qū)別是否患有宮頸癌的效率比較高。見表5。

表5 TCT聯(lián)合PCR12+2檢測與組織病理學(xué)檢查的關(guān)系表

2.4 三種篩選方法的比較

經(jīng)病理學(xué)檢測確診的43例宮頸癌患者中，經(jīng)TCT檢測出陽性病例31例，12例假陰性；經(jīng)PCR12+2檢測出陽性病例33例，10例假陰性；經(jīng)TCT聯(lián)合PCR12+2檢測，確診出陽性病例40人，3例假陰性，三組篩選方案經(jīng)卡方檢驗可知，χ2為6.65，P為0.04，小于0.05，可見三種檢測方案檢測能力有統(tǒng)計學(xué)差異。聯(lián)合檢測方案檢出正確率要比單獨的高，顯示聯(lián)合檢測方案的檢驗準(zhǔn)確性更好。

3 討論

我國宮頸癌的發(fā)病率和死亡率均居于世界前列，占據(jù)全世界的三分之一[4]。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌會從早期宮頸CIN不斷演變，隨著時間的發(fā)展早期CIN逐漸演變?yōu)樵缙诮櫚S后發(fā)展為浸潤癌。大量的研究結(jié)果顯示，早期宮頸原位癌的5年生存期超過100%，早期癌生存率在90%以上，而宮頸浸潤性癌只有67%[5，6]。

根據(jù)美國陰道鏡和宮頸病理協(xié)會(American Society forColposcopy and Cervical Pathology，ASCCP)發(fā)布的指南建議：年齡≥30歲的婦女，如果宮頸細(xì)胞學(xué)檢查陰性，但HR、HPV陽性可以選擇在12個月后復(fù)檢HPV和宮頸細(xì)胞，或者直接進行HPV16和HPV18的分型檢測，如果檢測結(jié)果陽性應(yīng)立即進行陰道鏡檢查，而那些HPV16和(或)18陰性，但其他型別HR-HPV陽性者，應(yīng)該在12個月后重復(fù)進行細(xì)胞學(xué)檢查和HR-HPV檢測，葉波等對1374例宮頸鱗癌患者的HPV檢測中發(fā)現(xiàn)，HPV16和HPV18可以在74.3%的宮頸癌病例中被檢測到[7]。此外，HPV18還引起了超過35%的宮頸腺癌的發(fā)生，而宮頸腺癌通過現(xiàn)有的細(xì)胞學(xué)篩查手段是很難發(fā)現(xiàn)的。

本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果存在定量差異，許劍利[8]等回顧性分析了184例患者行高危型HPV檢測及TCT檢查，比較兩種檢測方法在宮頸癌篩查中陽性和陰性預(yù)測值，結(jié)果顯示184例患者中63例病理檢查結(jié)果為陽性，陽性預(yù)測值分別為34.23%、50.00%，陰性預(yù)測值分別為0、67.06%，二者應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用于宮頸癌的篩查具有更高的準(zhǔn)確性。臧元怡[9]等對2140例門診宮頸標(biāo)本同時行HR-HPV檢測和TCT檢查，結(jié)果顯示HR-HPV DNA檢測與TCT聯(lián)合檢測靈敏度(95.64%)、陽性預(yù)測值(43.07%)及陰性預(yù)測值(98.75%)與單獨檢查比較均有不同程度的提高(P<0.05)。本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果存在定量差異，分析原因，考慮與樣本數(shù)量不同；TCT取材位置不當(dāng)(未包括整個宮頸液基表面，特別是絕經(jīng)后婦女，鱗柱交界退縮至頸管內(nèi)，刮片時不易刮到)；染色液未及時更換，核染色過淺，看不清染色質(zhì)結(jié)構(gòu)；光源不穩(wěn)定導(dǎo)致光線太弱看不清核的結(jié)構(gòu)，光線太強，核內(nèi)染色質(zhì)變淺，易把惡性誤認(rèn)為良性[10]；HPV檢測結(jié)果受實驗溫度、pH等因素有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，TCT聯(lián)合HR-HPV檢測在宮頸癌篩查中均具有良好的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性：TCT與HR-HPV的PCR檢測均采用專門的采樣器采集子宮頸細(xì)胞樣本，并將樣本置入裝有細(xì)胞保存液的小瓶中進行漂洗，可有效確保獲取足量、有效的宮頸脫落細(xì)胞樣本，同時前者通過對樣本進行分散和過濾后，可有效清除宮頸黏液和炎性細(xì)胞，減少對檢測的干擾；而后者則可能通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標(biāo)記跟蹤和實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，利用其高通量特性對HR-HPV基因亞型進行同步檢測和篩查，從而準(zhǔn)確檢測HR-HPV及其分型，且二者相比于傳統(tǒng)病理學(xué)檢測，可有效減少樣本采集操作對患者的創(chuàng)傷，且操作也較為簡單和快速，更適合于大范圍人群的篩查。故TCT聯(lián)合HR-HPV的PCR檢測適合作為臨床宮頸癌篩查方法[11]。

此外，本研究通過對不同方法篩查宮頸癌的效能進行對比，發(fā)現(xiàn)TCT聯(lián)合HR-HPV檢測的敏感度、準(zhǔn)確度明顯高于單獨TCT檢測，前者漏診率明顯低于后者，但兩種檢測方法在宮頸癌篩查中的特異度和誤診率基本相同。這可能是由于HR-HPV感染后人體后，引起機體宮頸黏膜的鱗狀上皮增殖而出現(xiàn)上皮細(xì)胞受損癥狀，顯著增加誘發(fā)宮頸病變的風(fēng)險，檢測是否感染雖可協(xié)助醫(yī)師進一步篩查宮頸癌，但并非所有HR-HPV患者會伴隨出現(xiàn)宮頸病變癥狀，且在HR-HPV感染并引起宮頸病變的過程中，可能需要一定的時間，同時出現(xiàn)宮頸病變后并非所有HR-HPV患者會發(fā)生發(fā)展為癌變，故其對宮頸癌變并無特異性，這也提示當(dāng)患者持續(xù)出現(xiàn)HR-HPV感染癥狀 ，其出現(xiàn)宮頸病變及癌變的風(fēng)險會呈持續(xù)不斷增加的趨勢，因此可將HR-HPV的PCR檢測作為宮頸癌篩查中必要的手段之一，并不斷擴大篩查范圍，除有效提高宮頸癌篩查的敏感性和準(zhǔn)確性外，還可指導(dǎo)對檢測結(jié)果陽性者進行早期的干預(yù)治療，進而降低宮頸癌發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險，提高高危人群的治療療效。

綜上所述，TCT聯(lián)合HR-HPV的PCR檢測在宮頸癌篩查中具有更為良好的敏感性和準(zhǔn)確性，有利于避免漏診的發(fā)生，且具有操作簡單、快捷、低創(chuàng)等優(yōu)點，值得臨床作進一步推廣。

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Nucleic acid real-time fluorescence PCR detecting high risk HPV(type 16 and 18)combined with TCT to screen cervical cancer

LI Hai-ping1，GAO Bo-wen2

(Department of Gynecological Oncology，Qinghai University Affiliated Hospital；2.Logistics University of PAP)

Objective To analyze the value of nucleic acid real-time polymerase chain reaction method on detection of high risk HPV(16 and 18 type)(PCR12+2) combined with TCT to screen cervical cancer.Methods 480 cases of cervical cancer screening were examined as follows：Thin - layer liquid-based cytology(TCT)of cervical exfoliative cells and real-time PCR detection of nucleic acid，andclassification detection(PCR12+2)，colposcopic biopsy and histopathological examination of HPV6 and HPV18.Results There was no significant difference in pathological examination of cervical intraepithelial neoplasia(CIN II)among the three groups(χ2=3．35，P>0.05).The positive rate of each group were as follows：TCT group 59.09%，PCR group 64.0%，combined group 94.44%，respectively.The positive rate of combined detection was significantly higher than those of HPV16 and HPV18 which were carried out respectively，and the difference was significant(P<0.05).Conclusion The real-time PCR assay for detection of high-risk HPV(type 16 and 18)(PCR12+2)combined with TCT for cervical cancer screening show higher positive rate and better accuracy for diagnosis.

Nucleic acid RT-PCR HPV Thinprep Cytology Test Cervical cancer

※：青海省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目課題2015年指導(dǎo)性科研課題 李海萍(1972～)女，滿族，青海籍，副教授

R323

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.04.010

2016-03-03