張曉娟，胡選萍，趙輝（.陜西理工學(xué)院生物學(xué)院，陜西漢中7300；.陜西理工學(xué)院體育學(xué)院，陜西漢中7300）

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銀杏蛋白提取純化及其功能應(yīng)用研究進(jìn)展

張曉娟1，胡選萍1，趙輝2
（1.陜西理工學(xué)院生物學(xué)院，陜西漢中723001；2.陜西理工學(xué)院體育學(xué)院，陜西漢中723001）

摘要：綜述了銀杏葉及種仁中蛋白的研究概況，從銀杏蛋白分離純化、性質(zhì)功能及應(yīng)用等方面進(jìn)行論述，并對(duì)銀杏蛋白進(jìn)一步研究方向、開發(fā)應(yīng)用前景進(jìn)行了探討，為銀杏蛋白進(jìn)一步研究及產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：銀杏蛋白；提取純化；應(yīng)用

銀杏（Ginkgo biloba）俗稱白果樹，起源于中國(guó)，為銀杏科銀杏屬多年生落葉喬木，距今已2億多年，是稀有的裸子植物。銀杏是世界上珍貴的藥用植物資源，其葉、果均有較高的藥用價(jià)值。銀杏具有很強(qiáng)的抗病原菌侵染能力。因此，自然界中，銀杏幾乎不染病。我國(guó)的銀杏資源約占世界70%，銀杏產(chǎn)品開發(fā)具有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)。近年來，銀杏研究主要集中在銀杏葉提取物及其在醫(yī)藥保健方面的作用［1-4］，關(guān)于銀杏蛋白的研究較少。銀杏蛋白主要由兩種不同分子量的蛋白組成，一種分子量為50 000，包含一個(gè)α酸性亞基和β堿性亞基，二者通過二硫鍵締合；另一種蛋白分子量為31 000，同樣是由一個(gè)α酸性亞基和β堿性亞基通過二硫鍵締合而成［5］。銀杏葉主要含醇溶性蛋白質(zhì)，銀杏種子以水溶性和鹽溶性蛋白質(zhì)為主，主要有白蛋白、球蛋白，含有少量的醇溶蛋白和堿溶蛋白、谷蛋白［6］。銀杏種仁中蛋白質(zhì)的含量在10%左右（干基含量）。銀杏種仁蛋白氨基酸組成合理，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白。

研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉及種仁中存在抗菌蛋白，對(duì)病原菌具有抑制作用，可用于病原菌的生物防治，在減輕病原菌對(duì)農(nóng)作物危害的同時(shí)，避免了化學(xué)防治對(duì)人及環(huán)境的危害。因此，其研究意義重大?？咕鞍资蔷哂锌咕钚缘亩嚯?、蛋白質(zhì)、不同蛋白的復(fù)合物或者蛋白與糖或脂的復(fù)合物，分子量多為幾百到30 000 Da以上。從植物中純化的大部分抗菌蛋白一般對(duì)某些真菌有較強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)細(xì)菌幾乎沒有抑制作用［7］。

目前，關(guān)于銀杏蛋白研究的綜述較少，本文論述了銀杏蛋白的分離提純、性質(zhì)功能、開發(fā)利用現(xiàn)狀及前景，為進(jìn)一步研究提供參考。

1　銀杏種仁蛋白的提取純化

1.1提取

近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)銀杏蛋白的研究主要集中在提取和功能性質(zhì)上，制備蛋白的方法有水提法、酶法（糖酶、蛋白酶、植酸酶和復(fù)合酶法等）、堿提酸沉法、物理分離法以及有機(jī)溶劑法制備等，水提法提取率低［8］。酶法提取成本較高，物理分離法對(duì)設(shè)備要求較高，有機(jī)溶劑提取易造成有機(jī)溶劑殘留且生產(chǎn)成分較高。相比之下，堿法提取工藝簡(jiǎn)單、成本低，制備得到的蛋白具有良好的起泡性、吸油性和持水性等特性，可用于食品加工，因而在蛋白制備中普遍使用。堿提酸沉法提取銀杏種仁蛋白流程為：銀杏種仁冷凍干燥，粉碎—脫脂—4℃，NaOH溶液提取—離心—上清調(diào)pH至4.62—沉淀即為銀杏種仁蛋白。

為進(jìn)一步提高銀杏蛋白提取率，許多研究對(duì)銀杏蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。賈韶千等［9］應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)堿法提取銀杏種仁蛋白工藝進(jìn)行了優(yōu)化。在提取時(shí)間12 h、料液比1∶26 g/mL、NaOH濃度0.2%條件下，蛋白的提取量為99.99mg/g，提取率達(dá)到了89.14%。

黃小炯等［10］采用磷酸緩沖液浸提，硫酸銨分級(jí)沉淀法得出銀杏果仁抗菌粗蛋白適宜提取條件為：銀杏果仁與磷酸緩沖液的料液比為1∶4 g/mL，溫度4℃，pH為7.0條件下提取6 h。研究通過4種溶劑從銀杏果仁抗菌粗蛋白中分離出4種不同溶解性的粗蛋白，其中水溶性蛋白質(zhì)的抑菌性最強(qiáng)。李盼盼等［11］采用超聲輔助法提取銀杏蛋白，通過Central-Composite中心組合設(shè)計(jì)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得最佳提取條件為提取溫度45℃，液料比20∶1 mL/g，pH 10，超聲時(shí)間20 min，功率300 W，在此試驗(yàn)條件下蛋白溶出量為61.748 g/mL。張風(fēng)梅等［12］得到銀杏鹽溶蛋白優(yōu)化提取工藝，NaCl濃度為0.14 mol/L，pH為8.0，提取溫度4℃、時(shí)間4 h，浸提次數(shù)大于3次。

1.2純化

牛衛(wèi)寧等［13］將銀杏果仁經(jīng)硫酸銨沉淀，上清經(jīng)CM-52離子交換柱層析和SephadexG-50凝膠過濾層析后分離純化出一個(gè)分子量為13 000 Da的抗菌蛋白。劉縉等［14］通過40%及80%（NH4）2SO4分級(jí)鹽析，CM Sephorose F.F.離子交換層析和Superdex 75凝膠過濾層析，從銀杏種仁中分離純化到一種表觀分子量約為12 kD的抗菌蛋白，該蛋白對(duì)真菌黃瓜鐮刀孢菌（Fusariumoxysporum）具有明顯的抑制作用。Huang等［15］通過DEAE-Cellulose 52對(duì)白果清蛋白進(jìn)行初步分離純化得到4個(gè)蛋白峰段（G1，G2，G3和G4），G4蛋白溶液經(jīng)Sephadex G25去鹽，PEG2000濃縮，通過DEAESephadex A50進(jìn)一步對(duì)G4蛋白峰進(jìn)一步純化，最終從白果清蛋白中純化出一種新的具有強(qiáng)氧化性的分子量為29，247 Da的蛋白G4b。Yang等［16］將銀杏果仁粗蛋白提取液通過40%～80%硫酸銨沉淀預(yù)處理，DEAE-cellulose 52柱純化，再經(jīng)過Sephadex G-200純化得一種分子量為32.12 kDa的糖蛋白，為進(jìn)一步研究該蛋白的性質(zhì)功能奠定基礎(chǔ)。Fan等［17］通過響應(yīng)面法對(duì)銀杏粗蛋白的微波冷凍干燥工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得出最佳工藝為微波功率：408W～421W，材料厚度15mm，預(yù)冷溫度：-20℃至-21℃。

2　銀杏蛋白性質(zhì)功能及應(yīng)用

2.1性質(zhì)功能

國(guó)內(nèi)外對(duì)銀杏種仁蛋白的性質(zhì)功能研究發(fā)現(xiàn)，銀杏種仁蛋白具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抗衰老、和免疫調(diào)節(jié)等作用［18-22］，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

Huang等［15］從銀杏葉中鑒定出一種分子量為4 244.0 Da的一種蛋白GAFP，發(fā)現(xiàn)它對(duì)佐佐木薄膜革菌（P.sasakii Ito），鏈格孢菌（A.alternata（Fries）Keissler），禾谷鐮孢菌（F.graminearum Schw）和串珠鐮刀菌（F.moniliforme）有抑制作用，抗菌活性在不同的真菌中存在差異。白果清蛋白能顯著增強(qiáng)小鼠的免疫調(diào)節(jié)能力［21］；具有抑制S180腫瘤生長(zhǎng)作用，該作用可能與其抗氧化活性有關(guān)［19］；能在一定程度上延緩自然衰老小鼠及半乳糖亞急性致衰老模型小鼠的衰老過程［20］。研究表明銀杏蛋白G4b還具有抑制DNA損傷，保護(hù)機(jī)體DNA的作用，當(dāng)G4b濃度為500 μg/mL，抑制率達(dá)到90.3%［15］。研究表明銀杏球蛋白乳化能力、乳化穩(wěn)定性、黏度均高于銀杏清蛋白。Deng等［23］對(duì)分離到的白果分離蛋白（GPI）、白果清蛋白（GAP）和白果球蛋白（GGP）的性質(zhì)功能進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)GAP具有很強(qiáng)的吸油能力（9.3 mL/g）、發(fā)泡性（67.8%）、乳化性（65.4%）和乳化穩(wěn)定性（90.6%），GPI的吸水性最高（1.93 mL/g），GGP的泡沫穩(wěn)定性最高（55.5%）。

2.2應(yīng)用

白果蛋白及其深加工產(chǎn)品——銀杏多肽可作為功能添加劑應(yīng)用于藥品開發(fā)及食品領(lǐng)域。銀杏抗菌蛋白（肽）可用于動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因工程。通過導(dǎo)入抗菌肽基因，獲得抗病植株，從而應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)；利用基因工程途徑生產(chǎn)抗菌肽，可解決從生物體中提取抗菌肽成本高、得率低的問題。

近年來，銀杏多肽制備成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。多肽具有多種生物活性，其生物效價(jià)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比游離氨基酸更高，因此，將銀杏蛋白進(jìn)一步酶解加工成銀杏多肽是銀杏產(chǎn)品深加工的一條有效途徑。目前研究較多的銀杏多肽是銀杏抗氧化肽，后者具有較強(qiáng)的抗氧化活性對(duì)脂質(zhì)過氧化有一定的抑制作用，可作為一種廣泛的氧化劑，安全性高，可兼做食品藥品。銀杏多肽制備主要采用酶法生產(chǎn)，具有安全性極高、價(jià)廉、條件易控制等優(yōu)點(diǎn)［24-26］。酶的選擇是生產(chǎn)多肽的關(guān)鍵。單一蛋白酶只能使少量蛋白溶解，采用兩種以上的蛋白酶水解效果較好。酶法生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟是酶解物中多肽的分離純化。張煥新等［27］采用Alcalase堿性蛋白酶水解銀杏果蛋白，對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行超濾獲得小分子量的銀杏肽。賈韶千等［28］采用葡聚糖凝膠sephadexG-25、sephadexG-10和反相高效液相色譜（RP-HPLC）對(duì)銀杏種仁蛋白的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得到了純度較高的抗氧化肽組分C8和C9，通過液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定C8的分子量為452.21 Da，并通過全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定其氨基酸組成。

3　前景展望

近些年，植物源產(chǎn)品的開發(fā)成為研究熱點(diǎn)。我國(guó)銀杏資源的開發(fā)利用起步較晚。目前，市場(chǎng)上有關(guān)銀杏的深加工產(chǎn)品比較單一，主要以銀杏提取物為主，銀杏產(chǎn)品深加工迫在眉睫。近年來，病原菌對(duì)農(nóng)作物的危害不斷加重，利用銀杏抗菌蛋白對(duì)病原菌進(jìn)行防治安全環(huán)保，是病害防治的一個(gè)趨勢(shì)，因此，深入研究銀杏葉及果仁中的抗菌蛋白，進(jìn)一步優(yōu)化其提取純化工藝意義重大。以銀杏蛋白為原料酶法生產(chǎn)銀杏抗氧化肽解決了其在銀杏植物體內(nèi)含量較低的問題，發(fā)展前景廣闊。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，銀杏果仁中含有糖蛋白，糖蛋白參與生物體的細(xì)胞識(shí)別及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、降血壓、血脂、抗氧化和抗衰中發(fā)揮重要作用［29］。目前，有關(guān)銀杏糖蛋白的研究較少，有研究證實(shí)從白果中分離的具有抗氧化和抗衰老作用的多個(gè)分子量為29 248 Da的白果清蛋白是一種糖蛋白［16］，銀杏糖蛋白的研究將豐富蛋白質(zhì)的作用及機(jī)理，同時(shí)為銀杏產(chǎn)品的開發(fā)開辟了一條新途徑。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.046

基金項(xiàng)目：陜西省科技廳項(xiàng)目（2014K14-03-03）

作者簡(jiǎn)介：張曉娟（1980—），女（漢），講師，在讀博士，從事生物工程專業(yè)教學(xué)及科研。

收稿日期：2015-04-05

Research Progress on Extraction，Purification，F(xiàn)unction and Application of Ginkgo biloba Proteins

ZHANG Xiao-juan1，HU Xuan-ping1，ZHAO Hui2

（1．School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001，Shaanxi，China；2．Department of Physical Education，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001，Shaanxi，China）

Abstract：This article summary the research progress of proteins from ginkgo leaf and seed.It contains extraction and purification，character and function，application of the Ginkgo biloba protein.In addition，discussion of research direction，prospective of development and application of Ginkgo biloba protein were also included. This paper provide basis for research and product development of the Ginkgo biloba protein.

Key words：proteins of Ginkgo biloba；extraction and purification；application