代曉航，郭靈安，魏　超

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川成都610066；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（成都），四川成都610066）

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腸炎沙門(mén)氏菌對(duì)新鮮番茄的附著和滲透

代曉航1，2，郭靈安1，2，魏超1，2

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川成都610066；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（成都），四川成都610066）

摘要：通過(guò)對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌在新鮮番茄不同部位的存活情況，包括模式、時(shí)間的研究，旨在對(duì)番茄中沙門(mén)氏菌污染進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分析并為找到腸炎沙門(mén)氏菌在番茄上附著與存活最小化的干預(yù)方法提供科學(xué)依據(jù)。采用不同處理方法對(duì)番茄上腸炎沙門(mén)氏菌的生存量進(jìn)行研究，包括不同人工污染程度及部位，不同貯存時(shí)間和溫度，分別取番茄污染表皮處和果肉進(jìn)行沙門(mén)氏菌定性和MPN法定量檢測(cè)，并結(jié)合電鏡觀(guān)察番茄表面結(jié)構(gòu),分析附著滲透可能。結(jié)果表明：番茄表皮及果蒂多孔形態(tài)給微生物的附著和滲透提供一定的條件，人工接種30d后，仍可在番茄果皮、果肉、果蒂處分離到腸炎沙門(mén)氏菌，并且附著與滲透易發(fā)生在果蒂和破損表皮處。因此，沙門(mén)氏菌可長(zhǎng)期存活于番茄表皮及內(nèi)部，表面多孔結(jié)構(gòu)保護(hù)腸炎沙門(mén)氏菌免受清洗的影響，為生食帶來(lái)安全隱患。

關(guān)鍵詞：番茄；腸炎沙門(mén)氏菌；附著；滲透

0　引言

果蔬感染微生物的途徑貫穿整個(gè)生產(chǎn)、加工、流通環(huán)節(jié)，特別是加工及貯藏期的二次污染[1]。2008年美國(guó)爆發(fā)的番茄沙門(mén)氏菌污染事件就造成了上千人感染[2]。近幾年，國(guó)內(nèi)多名研究者對(duì)我國(guó)果蔬微生物性食品安全提出了很多意見(jiàn)和建議，包括管理的提高和相關(guān)產(chǎn)品方法及檢測(cè)方法的推進(jìn)[3]。對(duì)于番茄中天然抗菌素番茄堿的研究也有不少，但其抑菌作用主要針對(duì)真菌和一些腐敗菌[4]，鮮見(jiàn)沙門(mén)氏菌在番茄上存活情況的研究。果蔬表面有天然的微生物群落，一般由有益微生物組成，且番茄pH值在4～5之間，屬于弱酸性果蔬，所以，通常番茄表面及內(nèi)部并不能給沙門(mén)氏菌提供最適生長(zhǎng)環(huán)境，有研究者也做過(guò)相關(guān)的報(bào)道[5]。但是，當(dāng)沙門(mén)氏菌污染番茄后，他在番茄中存活情況尚需研究。

本文采用人工染菌的方法，通過(guò)對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌在番茄上的存活時(shí)間及內(nèi)化情況進(jìn)行研究，旨在為番茄中沙門(mén)氏菌污染風(fēng)險(xiǎn)分析和找到沙門(mén)氏菌在番茄上附著與存活最小化的干預(yù)方法提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試材料

試劑及培養(yǎng)基：緩沖蛋白胨水（0.1%）、TTB、SC、沙門(mén)氏菌科瑪嘉顯色培養(yǎng)基均購(gòu)于杭州微生物試劑公司；ID32E試劑條、JAMES試劑、氧化酶購(gòu)于生物梅里埃公司；標(biāo)準(zhǔn)菌株：腸炎沙門(mén)氏菌（CICC21482）購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保存管理中心。

樣品：番茄（確認(rèn)無(wú)沙門(mén)氏菌污染）。

儀器和設(shè)備：高壓滅菌鍋，上海三申FM75；DHP-9082培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；拍擊式均質(zhì)器（寧波新芝）；Baby Gravimat重量稀釋儀（法國(guó)Interscience）；ATB微生物鑒定儀（法國(guó)梅里埃公司）；JSM-7500F型掃描電子顯微鏡（日本電子）；HF safe-1200生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1人工染菌

將腸炎沙門(mén)氏菌（CICC21482）制備成一定的麥?zhǔn)蠞舛葮?biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液，對(duì)樣品分別用浸蘸和點(diǎn)植兩種方法進(jìn)行人工污染。浸蘸接種，優(yōu)點(diǎn)是可模擬嚴(yán)重灌溉污染、徑流污染與水槽灌溉污染。點(diǎn)植接種，可比較不同部位附著情況，且各接種點(diǎn)接種量均勻一致[6]。本文同時(shí)采用以下幾種方法進(jìn)行人工染菌：樣品浸在菌懸液中，菌懸液點(diǎn)植在番茄果蒂、光滑表面、有破損表面處。

1.2.2樣品放置

一般市售番茄都在紅熟期，不同天氣的儲(chǔ)存期有所不同，按照飲食習(xí)慣通常不超過(guò)半個(gè)月就會(huì)被食用，將制備好的樣品靜置于低溫5℃和常溫20℃下，分別放置在5，15d后進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，定性實(shí)驗(yàn)延長(zhǎng)至30d。

1.2.3樣品檢測(cè)

浸蘸接種的樣品需檢測(cè)樣品表皮、果肉，點(diǎn)植接種的樣品需檢測(cè)各點(diǎn)植部位表皮及內(nèi)部果肉。在做表皮分析時(shí)，結(jié)合Annous等[7]從瓜皮表面回收細(xì)菌的方法，將待檢番茄用超聲波清洗，達(dá)到回收表皮微生物的目的，果肉部分則直接無(wú)菌切取。定性檢測(cè)方法參照GB 4789.4——2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏門(mén)菌檢驗(yàn)》，稱(chēng)取25g樣品至225mL BPW進(jìn)行前增菌、取1mL前增菌液至TTB和SC進(jìn)行二次增菌、劃線(xiàn)到XLD和科瑪嘉顯色培養(yǎng)進(jìn)行分離、最后通過(guò)ATB生化鑒定儀進(jìn)行生化鑒定并做血清確認(rèn)。定量檢測(cè)方法參照SN/T 0040——1992《出口食品沙門(mén)氏菌屬（包括亞利桑那菌）計(jì)數(shù)檢驗(yàn)方法行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》及張秀麗等[8]關(guān)于兩種沙門(mén)氏菌定量計(jì)數(shù)方法比較，采用最大可能數(shù)（MPN）法，將樣品按不同稀釋度接種到3組增菌液中，每組3管，共9管，分離鑒定方法同定性方法，最后查MPN表得到結(jié)果。

1.2.4電鏡實(shí)驗(yàn)

將番茄表皮和果蒂切片，自然干燥后，掃描電子顯微鏡觀(guān)察。

2　結(jié)果與分析

表1　生化鑒定結(jié)果

通過(guò)生化及血清實(shí)驗(yàn)，定性確認(rèn)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表可知，ATB最終結(jié)論為，細(xì)菌名稱(chēng)：沙門(mén)菌屬（Salmonella spp）；評(píng)語(yǔ)：極好的鑒定；ID%：99.9%；T值：0.88。其中，ID%（鑒定百分率）評(píng)估了待測(cè)菌的測(cè)定結(jié)果譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中不同分類(lèi)的相對(duì)接近程度，T值評(píng)估了待測(cè)菌的測(cè)定結(jié)果譜與每一種分類(lèi)最典型的反應(yīng)結(jié)果譜的符合程度。血清試驗(yàn)：沙門(mén)氏菌多價(jià)A-F凝集。

通過(guò)定性實(shí)驗(yàn)研究腸炎沙門(mén)氏菌在番茄果皮及果肉上存活時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表2。由表可知，腸炎沙門(mén)氏菌在番茄上的存活時(shí)間與番茄本身被污染程度、環(huán)境溫度、被污染部位有關(guān)。番茄被接種該菌30d后，仍可在果皮、果肉、果蒂痕部被分離到。低溫（5℃）下的存活時(shí)間低于常溫（20℃）；浸蘸接種，即嚴(yán)重污染后該菌的存活時(shí)間也較點(diǎn)植接種后存活時(shí)間要長(zhǎng)。與完整果皮相比，該菌在破損果皮及果蒂處的存活時(shí)間更長(zhǎng)。這是由于完整果皮由蠟質(zhì)的角質(zhì)層組成，與其他部位相比不利于人類(lèi)病原菌附著[9]。

表2　腸炎沙門(mén)氏菌在果皮及果肉上存活時(shí)間

表3　腸炎沙門(mén)氏菌在果實(shí)上的附著滲透數(shù)量

通過(guò)定量實(shí)驗(yàn)研究腸炎沙門(mén)氏菌在在番茄果皮及果肉上存活量，結(jié)果見(jiàn)表3。可以看出，本文所用標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)番茄果蒂的附著能力整體高于對(duì)果皮的附著；常溫（20℃）下的附著能力高于低溫（5℃）；15d后的附著量要少于5d；對(duì)完整表皮通過(guò)浸蘸接種后進(jìn)入果肉的能力略強(qiáng)于點(diǎn)植接種；而該菌通過(guò)破損表皮及果蒂處進(jìn)入果肉的能力相對(duì)較強(qiáng)，所以細(xì)菌可通過(guò)傷口快速內(nèi)化。微生物通常通過(guò)表皮滲入或間接通過(guò)氣孔、皮孔、排水器或傷口等進(jìn)入植物體內(nèi)，這些都是有助于微生物內(nèi)化的植物結(jié)構(gòu)。

通過(guò)電鏡實(shí)驗(yàn)觀(guān)察番茄表皮及果蒂處形態(tài)，如圖1所示。由圖可見(jiàn)，番茄表面光滑但也具有網(wǎng)狀多孔組織，所以微生物在其表皮的附著能力較低，但可通過(guò)滲透進(jìn)入組織內(nèi)部。而果蒂組織存在大量的孔狀結(jié)構(gòu)，而且凹凸不平，這樣的組織結(jié)構(gòu)為微生物提供了大量的附著位點(diǎn)，同時(shí)，可能的內(nèi)化也易于發(fā)生在該處。這與本文結(jié)果相符。

3　結(jié)束語(yǔ)

圖1　番茄表面與果蒂形態(tài)掃描電鏡圖

在有關(guān)腸道病原菌對(duì)植物潛在附著因子的研究中發(fā)現(xiàn)，1型菌毛、IVB纖毛和細(xì)聚合菌毛都是腸炎沙門(mén)氏菌的吸附因素。而番茄表面天然形成的縫隙、傷口以及果蒂都是微生物附著和內(nèi)化的主要途徑，但是各部位附著及內(nèi)化程度有差異，同時(shí)也受初始污染程度、環(huán)境溫度的影響。嚴(yán)重污染后30 d仍可在表皮及果肉處分離到該菌，即便是輕微污染，20d后仍可能分離到該菌，所以腸炎沙門(mén)氏菌在番茄上的附著和內(nèi)化能力較強(qiáng)。本研究也表明，20℃下的存活能力明顯高于5℃，與前人發(fā)現(xiàn)的沙門(mén)氏菌在萵苣、生菜上的存活時(shí)間和溫度類(lèi)似[10-11]。

所以，高溫季節(jié)更有利于微生物的生長(zhǎng)，雖然生食蔬菜時(shí)都會(huì)經(jīng)過(guò)清洗，但對(duì)果蔬的表面清洗并不能完全消除其安全隱患。通過(guò)電鏡觀(guān)察，番茄表皮及果蒂形態(tài)給微生物的附著和滲入提供了一定條件，同時(shí)保護(hù)腸炎沙門(mén)氏菌免受清洗的影響。建議消費(fèi)者選購(gòu)番茄時(shí)，應(yīng)注意有無(wú)創(chuàng)傷，果皮是否完整。應(yīng)冷藏貯存，清洗時(shí)特別注意縫隙處并去除果蒂部分。

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（編輯：莫婕）

Attachment and infiltration of Salmonella enterica to fresh tomatoes

DAI Xiaohang1，2，GUO Ling’an1，2，WEI Chao1，2
（1. Analysis and Testing Center of Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，China；2. Security Risk Assessment Laboratory of Ministry of Agriculture（Chengdu），Chengdu 610066，China）

Abstract:The survival-growth capacity of Salmonella enterica populations on different parts of tomatoes such as mode and time，which are investigated to provide a scientific basis for risk assessment as well as the design of intervention methods to minimize the attachment and infiltration of Salmonella enterica. The contaminated tomato skins and pulps were qualitatively and quantitatively detected and the infiltration probability was analyzed with a scanning electron microscope after different methods were used to study the survival amount of Salmonella enterica，including the grades and parts of artificial pollution as well as the storage time and temperature. The results indicate that the skin and the porous morphology of the stem have offered the microorganisms certain conditions for attachment and infiltration；Salmonella enterica could still be found in the tomato skin，pulp and stem 30 days after artificial inoculation. In other words，Salmonella enterica can survive in the skins and inner parts of the tomatoes for a long time，and hidden dangers may occur when tomatoes are consumed uncooked，because the porous structure of the tomato skin has protected Salmonella enterica from being washed away.

Keywords:tomatoes；Salmonella enterica；attachment；infiltration

通訊作者：郭靈安（1962-），男，副研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作。

作者簡(jiǎn)介：代曉航（1981-），女，四川峨眉山市人，助理研究員，碩士，主要從事食品與農(nóng)產(chǎn)品微生物檢測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作。

基金項(xiàng)目：2015年國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重大專(zhuān)項(xiàng)（GJFP201501402）；四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金項(xiàng)目（2013QNJJ-025）

收稿日期：2015-06-02；收到修改稿日期：2015-07-19

doi：10.11857/j.issn.1674-5124.2016.01.014

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-5124（2016）01-0061-04