景臨林，馬慧萍，樊鵬程，蒙　萍，賈正平

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730050)

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氮氧自由基與氨基酸偶聯(lián)物的設計合成與結構表征

景臨林，馬慧萍，樊鵬程，蒙萍，賈正平*

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730050)

摘要：將對甲酰基苯甲酸分別與氨基乙酸甲酯和4-氨基丁酸甲酯生成酰胺后，再分別與2,3-二甲基-2,3-二羥氨基丁烷進行縮合反應，最后經高碘酸鈉氧化得到兩種氮氧自由基與氨基酸偶聯(lián)物，并通過IR、EPR、EI-MS和元素分析對目標化合物的結構進行了表征.

關鍵詞：氮氧自由基；抑制性氨基酸；偶聯(lián)物；合成

氮氧自由基(NN)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型自由基清除劑，對·OH、O2-·、H2O2和NO均表現(xiàn)出較好的清除能力. 傳統(tǒng)自由基清除劑通常通過化學量的方式清除活性氧(ROS)，NN則是利用電子轉移在氧化態(tài)和還原態(tài)之間轉換，以“催化”的方式不斷清除ROS，具有擬超氧化物歧化酶(SOD)的效應[1]. 最新的研究表明，氮氧自由基可以減輕機體的氧化應激，對缺血再灌注損傷[2]、輻射損傷[3]具有明顯的保護作用，同時還具有抗腫瘤[4]和抗病毒[5]活性. 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)氮氧自由基還可以顯著緩解低壓低氧導致的小鼠心腦組織損傷[6]. 缺氧條件下，神經遞質代謝會出現(xiàn)紊亂，興奮性氨基酸過量釋放，細胞內Ca2+失穩(wěn)態(tài)[7]. 甘氨酸和γ-氨基丁酸是中樞神經系統(tǒng)中重要的抑制性神經遞質，能夠抑制興奮性氨基酸的毒性，同時可通過突觸后膜超極化減少離子內流，從而緩解缺氧對腦組織的損傷[8]. 甘氨酸還對缺氧導致的心肌細胞損傷具有明顯的保護作用，其機制可能是與減輕缺氧導致的細胞膜去極化，減少電壓依賴性Ca2+通道的開放和Ca2+的內流有關[9].

為了獲得抗缺氧活性更好的衍生物，本文作者以對甲?；郊兹┖蛢煞N抑制性氨基酸(甘氨酸和γ-氨基丁酸)為原料，根據藥物拼合原理，將氨基酸分子引入到氮氧自由基結構中，合成了兩種氮氧自由基與氨基酸偶聯(lián)物，產物結構經IR、 EI-MS、EPR和元素分析確認. 目標化合物合成路線見圖1.

1實驗部分

1.1　儀器與試劑

DHJF-2005低溫反應器，鄭州長城科工貿有限公司；NEXUS 670紅外光譜儀，KBr壓片，美國Nicolet公司；ER200DSRC10/12電子順磁共振波譜儀，瑞士Brucker公司；Vario EL cube元素分析儀，德國Elementar公司；Brucker AVANCE III 400核磁共振波譜儀，瑞士Brucker公司， LCMS-API 3200質譜儀，美國Applied Biosystems公司.

圖1　氮氧自由基與氨基酸偶聯(lián)物的合成路線Fig.1　Synthesis of nitronyl nitroxide-animo acid conjugates

CDCl3和DMSO-d6(TMS )購自Sigma公司；2-氨基乙酸甲酯鹽酸鹽、4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽、N-甲基嗎啉和溴乙酸乙酯購自阿拉丁試劑公司，對甲酰基苯甲酸購自上海邦成化工有限公司；GF254高效板和柱層析硅膠，青島海洋化工廠分廠；其他均為市售分析純試劑. 無水THF經金屬鈉處理.

1.2　二甲基-2,3-二羥氨基丁烷按照文獻[10]方法制備

1.3　2-(4-甲?；郊柞０坊?丁酸甲酯(1)

將對甲酰基苯甲酸(0.75 g， 5 mmol)和氨基乙酸甲酯鹽酸鹽(0.74 g，6 mmol)溶于50 mL無水THF中，低溫反應器冷卻至0 ℃，用N-甲基嗎啉調節(jié)pH=9. 緩慢滴加溶于20 mL 無水THF的DCC(1.22 g，6 mmol)，滴畢后0 ℃下繼續(xù)攪拌2 h，然后升溫至室溫繼續(xù)反應16 h，過濾，減壓除去THF，殘余物用少量二氯甲烷溶解后，快速柱層析分離(V石油醚∶VCH2Cl2∶V乙酸乙酯=1∶1∶1)，得白色粉末0.75 g，為化合物1，產率68%. ESI-MS(m/z)：222[M+H]+.1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ： 10.09(s， 1H)，7.94~7.99(m，4H)，6.94(s，1H)，4.27(d，J=5.2 Hz，2H)，3.82(s，3H).13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ： 191.5，170.3，166.4，138.65，138.30，129.8，127.8，109.71，52.53，41.73.

1.4　4-(4-甲?；郊柞０坊?丁酸甲酯(2)

將對甲?；郊姿?0.75 g，5 mmol)和4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽(0.92 g，6 mmol)溶于50 mL無水THF中，低溫反應器冷卻至0 ℃，用N-甲基嗎啉調節(jié)pH=9. 緩慢滴加溶于20 mL 無水THF的DCC(1.22 g，6 mmol)，滴畢后0 ℃下繼續(xù)攪拌2 h，然后室溫下繼續(xù)反應20 h，過濾，減壓除去THF，殘余物用少量二氯甲烷溶解后，快速柱層析分離(V石油醚∶VCH2Cl2∶V乙酸乙酯=1∶1∶1)，得白色粉末0.93 g，為化合物2. 產率75%. ESI-MS(m/z)：250[M+H]+.1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：10.08(s，1H)，7.95(s，4H)，6.94(s，1H)，3.68(s，3H)，3.52~3.56(m，2H)，2.49(t，2H)，1.96~2.03(m， 2H).13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ： 191.5，172.4，166.3，139.8，138.1，129.8，126.6，51.9，40.0，31.8，24.0.

1.5　2-(4-((2-甲氧基-2乙?；?氨基甲酰基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-咪唑啉-3-氧-1-氧基自由基(NN1)

將1.10 g(5 mmol)化合物1和0.74 g(5 mmol)2,3-二甲基-2,3-二羥氨基丁烷溶于25 mL甲醇中，回流反應12 h. 減壓除去甲醇，殘余物懸浮于25.0 mL CH2Cl2中，低溫反應器冷卻至0 ℃，加入15.0 mL NaIO4(0.85 g)水溶液，劇烈攪拌15 min后停止反應. 靜置分層后，水相用CH2Cl2萃取兩次，合并有機相，無水Na2SO4干燥過夜，過濾，減壓除去溶劑，得深藍色固體或油狀物，快速柱層析分離(V石油醚∶V乙酸乙酯= 7∶3)，得藍色固體0.78g，為目標化合物NN1. 產率45%. m.p.： 145.1~146.3 ℃. ESI-MS(m/z)：349 [M+H]+. IR(KBr)：3 378，2 949，1 763，1 668，1 548，1 525，1 365，1 318，1 209，1 167，846 cm-1. EPR(CH3OH)：五重峰，g =2.006 8，|aN| =7.64 G. Anal. Calcd for C17H22N3O5：C，58.61；H，6.37；N，12.06. Found：C，58.68；H，6.51；N，12.72.

1.6　2-(4-((4-甲氧基-4-丁甲?；?氨基甲酰基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-咪唑啉-3-氧-1-氧基自由基(NN2)

將1.24 g(5 mmol)化合物2和0.74 g(5 mmol)2,3-二甲基-2,3-二羥氨基丁烷溶于25 mL甲醇中，回流反應12 h. 減壓除去甲醇，殘余物懸浮于25.0 mL CH2Cl2中，低溫反應器冷卻至0 ℃，加入15.0 mL NaIO4(0.85 g)水溶液，劇烈攪拌15 min后停止反應. 靜置分層后，水相用CH2Cl2萃取兩次，合并有機相，無水Na2SO4干燥過夜，過濾，減壓除去溶劑，得深藍色固體或油狀物，快速柱層析分離(V石油醚∶V乙酸乙酯=2∶1)，藍色油狀物0.99 g，為目標化合物NN2. 產率53%. ESI-MS(m/z)：377 [M+H]+. IR(KBr)：3 369，2 988，2 948，1 736，1 645，1 545，1 525，1 429，1 363，1 309，1 207，1 169，854 cm-1. EPR(CH3OH)：五重峰，g =2.006 8，|aN| =7.64 G. Anal. Calcd for C19H26N3O5：C，60.62；H，6.96；N，11.16. Found：C，60.68；H，6.85；N，11.12.

2結果與討論

2.1　合成方法

醛和2,3-二甲基-2,3-二羥氨基丁烷經過縮合和氧化反應即可得到咪唑啉類氮氧自由基，這也是獲得該類氮氧自由基的唯一方法. 合成過程中，為了簡化反應操作，縮合和氧化反應采取一鍋法進行，縮合產物不需分離純化，直接進行氧化反應，最后經過一次柱層析即可得到純度較高的目標化合物. 在該合成路線中，控制氧化過程，避免出現(xiàn)氧化不完全和過氧化反應，是能否高產率獲得氮氧自由基的關鍵. 為了減少過氧化產物的生成，通過對反應條件的摸索，我們采取了以下三個措施：一是降低反應溫度，氧化反應過程始終在0 ℃下進行，避免反應過于劇烈；二是使用二氯甲烷和水的混合溶劑作為反應體系，將生成的氮氧自由基及時萃取到CH2Cl2相中，盡可能減少與氧化劑高碘酸鈉的接觸；三是控制高碘酸鈉的用量以及反應時間，最大限度地避免過氧化產物的生成.

2.2　結構表征

在化合物1和2的1H NMR譜中，10.00附近出現(xiàn)的單峰為醛基質子信號，6.90附近為酰胺鍵中質子信號，3.7 為酯基中甲氧基質子信號. 在13C NMR譜中，化合物1和2的酰胺基和酯基中羰基碳的位置分別為191.5，170.3和191.5，172.4. 酯基中甲氧基碳質子信號出現(xiàn)在52附近. 以上核磁數(shù)據與目標分子結構一致.

化合物NN1和NN2在核磁共振儀上沒有信號，無法通過NMR對其進行結構表征. 在它們的紅外譜圖中，NN1和NN2中酰胺和酯基中羰基的特征吸收峰分別在1 668，1 763 cm-1和1 645，1 736 cm-1處出現(xiàn)， N-O鍵的典型吸收峰出現(xiàn)在1 360 cm-1附近，1 208和1 545 cm-1附近出現(xiàn)C-N和C=N鍵特征吸收峰，酰胺鍵中N-H的伸縮振動出現(xiàn)在3 370 cm-1，850 cm-1附近的單峰表明是苯環(huán)中為1,4取代結構. 電子順磁共振(EPR)是觀察和檢測自由基等順磁性物質的一種最直接、最有效的方法[11]. 化合物NN1的EPR譜呈現(xiàn)對稱的五重峰，各峰強度比為1∶2∶3∶2∶1. 質譜和元素分析結果與目標分子一致.

圖3　化合物NN1的EPR譜Fig.3　EPR spectrum of compound NN1

3結論

為了獲得抗缺氧活性更加優(yōu)異的新型氮氧自由基衍生物，以對甲?；郊兹?、2-氨基乙酸甲酯和4-氨基丁酸甲酯為原料，通過三步反應，將氮氧自由基與氨基酸分子通過酰胺鍵相連，合成得到兩種新型氮氧自由基氨基酸偶聯(lián)物，反應操作簡單，條件溫和，產物結構經波譜分析與目標化合物一致，為下一步對其進行抗缺氧活性研究奠定了基礎.

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[責任編輯：任鐵鋼]

Synthesis and characterization of nitronyl nitroxide-amino

acid conjugates

JING Linlin, MA Huiping, FAN Pengcheng, MENG Ping, JIA Zhengping*

(DepartmentofPharmacy,LanzhouGeneralHospital,LanzhouCommandofCPLA,Lanzhou730050,Gansu,China)

Abstract:Synthesis was initiated with amidation reaction between 4-carboxybenzaldehyde and methyl glycinate or methyl 4-aminobutyrate respectively, followed by condensation with 2,3-dimethyl-2,3-dihydroxylamino butane yield the key intermediate compound 1 and 2, which was subsequently subjected to oxidize by sodium periodate to generate two nitronyl nitroxide-amino acid conjugates. The structure was characterized by IR, EI-MS, EPR and elemental analysis.

Keywords:nitronyl nitroxide; inhibitory amino acid; conjugate; synthesis

作者簡介：景臨林(1982-)，男，主管藥師，主要從事藥物合成研究.*通訊聯(lián)系人,E-mail: zhengpingjia@163.com.

基金項目：國家自然科學 (81202458)，全軍醫(yī)藥科研“十二五”面上項目(CLZ12JA04)，甘肅省自然科學基金(1308RJYA06)，中國博士后科學基金(2012M521926).

收稿日期：2015-06-24.

文章編號：1008-1011(2015)06-0597-04

中圖分類號：O629. 9

文獻標志碼：A