閆曉紅　安可英　毛艷華　宓寶斌　劉　莉

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,山東　濱州　256603)

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蕎麥花葉總黃酮對(duì)阿霉素致心力衰竭大鼠心功能及miR133a表達(dá)的影響

閆曉紅安可英毛艷華宓寶斌劉莉1

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,山東濱州256603)

〔摘要〕目的探討蕎麥花葉總黃酮(TFBFL)對(duì)阿霉素致心力衰竭大鼠模型心功能及miR133a表達(dá)的影響。方法選取Wistar大鼠90只，按隨機(jī)數(shù)字表達(dá)法隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、TFBFL高劑量組(400 mg/kg)，TFBFL低劑量組(100 mg/kg)和卡托普利組(10 mg/kg)，除了正常對(duì)照大鼠外，其他四組大鼠予以腹腔注射鹽酸阿霉素建立心力衰竭模型，于造模第4周起予以各組大鼠相應(yīng)的藥物進(jìn)行灌胃治療，1次/d，連續(xù)灌胃3 w。末次灌胃后采用彩色多普勒超聲診斷儀測(cè)定各組大鼠的心功能指標(biāo)射血分?jǐn)?shù)(EF)短軸縮短分?jǐn)?shù)(FS)；采用酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)各組大鼠動(dòng)脈血清的腦鈉肽(BNP)含量；采用熒光定量PCR檢測(cè)各組大鼠心臟組織miR133a相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果①正常對(duì)照組大鼠心功能指標(biāo)EF、FS及miR133a表達(dá)水平明顯高于模型組(P<0.05)，而動(dòng)脈血清中BNP含量較模型組明顯下降(P<0.01)；②經(jīng)過卡托普利、TFBFL治療后三組大鼠EF和FS較模型組明顯升高(P<0.01)，而三組動(dòng)脈血清BNP含量明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，三組間各指標(biāo)無明顯差異(P>0.05)；③經(jīng)過卡托普利和TFBFL治療后的三組大鼠心臟組織miR133a mRNA水平明顯升高，與正常對(duì)照組比較差異顯著(均P<0.05)，并以TFBFL低劑量組大鼠升高最為顯著；④TFBFL低劑量組大鼠心功能指標(biāo)及BNP含量改善程度較蕎麥花葉總黃酮高劑量組好，但二者無差異(P>0.05)。結(jié)論蕎麥花葉總黃酮能夠明顯提高阿霉素導(dǎo)致的心力衰竭模型大鼠的miR133a相對(duì)表達(dá)量，改善心功能，但心功能改善與蕎麥花葉總黃酮?jiǎng)┝课匆娒黠@的量效關(guān)系。

〔關(guān)鍵詞〕蕎麥花葉總黃酮；阿霉素；心力衰竭；心功能；miR133a

1海陽市人民醫(yī)院手術(shù)室

第一作者：閆曉紅(1979-)，女，主治醫(yī)師，主要從事臨床醫(yī)學(xué)研究。

心力衰竭多發(fā)于中老年人群，我國心力衰竭患者的發(fā)病率從1990年的0.7%上升至2010年的3.6%，并有逐年上升趨勢(shì)〔1〕。導(dǎo)致本病原因以原發(fā)性心肌損害和心臟負(fù)荷過重為主。研究發(fā)現(xiàn)〔2〕，從銀杏、黃芩等植物中提取的黃酮類化合物具有較好的降脂、擴(kuò)血管、抗血栓和抗氧化的作用。但國內(nèi)外從蕎麥花葉中提取出來的蕎麥花葉總黃酮(TFBFL)對(duì)心力衰竭臨床療效的研究報(bào)道較少。本文通過觀察心功能指標(biāo)、血清中腦鈉肽(BNP)及心臟組織微小RNA(miR133a)表達(dá)的水平變化，來探究TFBFL對(duì)心力衰竭的影響及作用機(jī)制。

1資料與方法

1.1動(dòng)物6周齡Wistar雄性大鼠90只，平均體重(153±14)g，大鼠購于中國科學(xué)院上海動(dòng)物中心(合格證號(hào)：D20021024)。

1.2藥品、試劑及儀器TFBFL：將采自于內(nèi)蒙古庫倫旗的蕎麥花葉研碎物，水浴加熱，收集濾液，3次水浴加熱后合并濾液，采用醇提后，干燥濾液，即得TFBFL，經(jīng)中國藥科大學(xué)藥物研究所鑒定黃酮含量為97.96%；鹽酸阿霉素(深圳萬樂藥業(yè)有限公司產(chǎn)，批號(hào)0509E1)；卡托普利片(廣州白云山制藥股份有限公司廣州白云山制藥總廠，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字p4021034，2010-07-16)；BNP試劑盒購于賽馳生物公司；Trizol試劑購于美國GIBCO公司；大鼠miR133a核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測(cè)試劑盒、超純RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于美國Promega公司；Philips-IE33彩色多普勒超聲診斷儀，購于美國PHILIPS公司，頻率為3～8 mHz小兒心臟探頭。

1.3心力衰竭大鼠模型建立及分組將90只Wistar雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表達(dá)法隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組(10 mg/kg)、TFBFL高劑量組(400 mg/kg)和TFBFL低劑量組(100 mg/kg)，每組18只。除正常對(duì)照組，其他四組大鼠每周一向腹腔注射0.8 mg/L的鹽酸阿霉素1次，第1～3周按3 mg/kg劑量注射，第4～6周按2 mg/kg劑量注射，正常對(duì)照組每周周一向腹腔注射等劑量的生理鹽水1次。腹腔注射鹽酸阿霉素第4周同時(shí)予以各組大鼠相應(yīng)的藥物灌胃，正常組和模型組予以10 mg/kg生理鹽水灌胃；卡托普利組予以10 mg/kg卡托普利灌胃；TFBFL高劑量組給予400 mg/kg TFBFL灌胃；TFBFL低劑量組給予100 mg/kg TFBFL灌胃，各組大鼠灌藥治療3 w，灌藥1次/d。采用BL420系統(tǒng)測(cè)量左心室功能標(biāo)志均比正常對(duì)照組大鼠低，說明心力衰竭大鼠模型建立成功。

1.4觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1各組大鼠心功能測(cè)定五組大鼠治療3 w后，用10%水合氯醛將大鼠進(jìn)行麻醉，胸口備皮，采用Philips-IE33彩色多普勒超聲診斷儀在超聲心動(dòng)圖下觀察左室長(zhǎng)軸切面、短軸二腔面和四腔面的腔室大小以及室壁的運(yùn)動(dòng)情況，采用心功能測(cè)定軟件包計(jì)算和分析射血分?jǐn)?shù)(EF)和短軸縮短分?jǐn)?shù)(FS)，連續(xù)測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期，取平均值作為EF及FS值。

1.4.2各組大鼠血液中BNP水平測(cè)定麻醉理想后，消毒，無菌操作下打開胸腔，剪開心包，暴露心臟及主動(dòng)脈，抽取主動(dòng)脈血5 ml，加入含乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝劑的真空管中混勻，采血后，游離心臟，取出心臟浸泡于10%中性甲醛溶液中，固定24 h。動(dòng)脈血3 000 r/min離心10 min，抽取血清，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定血清中BNP含量。

1.4.3miR133a mRNA水平的檢測(cè)

1.4.3.1總RNA的提取把取出的心臟組織剪碎、研磨，置于0.2%膠原酶中消化，采用D-Hank液清洗，置于4℃水中冰浴30 min，1 200 r/min離心8 min，制備成單細(xì)胞沉淀，向單細(xì)胞沉淀中加入1 ml Trizol試劑，采用超純RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA。實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，用紫外分光光度法測(cè)定RNA的A260/A280確定總RNA純度。

1.4.3.2反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作，按照相關(guān)文獻(xiàn)資料設(shè)計(jì)PCR中內(nèi)參照甘油酯-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和miR133a引物，將RNA模板、引物、5xRT Buffer 和RNase-freeWater溶解并置于冰上備用，將2 μl Primer mix試劑和10 μl消化后RNA分別加入20 μl反應(yīng)體系的第一部分，混勻。PCR反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq (2×)10 μl，PCR Forward Primer (10 μmol/L)0.4 μl，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μl，ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μl，cDNA模板2 μl，dH2O 6.8 μl，總反應(yīng)體系為20 μl。經(jīng)過PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化,PCR循環(huán)條件為94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 1 min,共35個(gè)循環(huán),最后72℃再延伸5 min。miR133a:引物序列：正義：5′-CACCTATGTAAGATCGCTTC-3′；反義：5′-GCACAATCGCCATAATTATCC-3′，產(chǎn)物大小444 bp；GAPDH正義：5′-TATGACAACTCCCTCAAGAT-3′，反義：5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′，產(chǎn)物大小320 bp。

1.4.3.3結(jié)果分析PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,溴化乙啶染色，通過成像分析scion軟件計(jì)算和比較miR133a產(chǎn)物條帶的吸光度值，并與GAPDH條帶光密度值比較，計(jì)算出miR133a在球囊損傷模型大鼠主動(dòng)脈組織中mRNA表達(dá)含量相對(duì)值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1各組大鼠心功能指標(biāo)比較正常對(duì)照組大鼠心功能指標(biāo)EF%〔(92.36±3.89)%〕及FS%〔(60.15±7.54)%〕明顯高于模型組〔(71.26±4.18)%，(36.48±3.85)%〕(P<0.01)；卡托普利組、TFBFL高、低劑量組大鼠EF%〔(85.32±3.64)%、(80.35±4.84)%、(85.71±4.21)%〕及FS%〔(50.14±6.36)%、(43.36±5.48)%、(49.2±4.59)%〕較模型組升高(P<0.01)，但三組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TFBFL低劑量組大鼠心功能指標(biāo)處于一個(gè)較高水平，但與TFBFL高劑量組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2五組大鼠心臟組織中miR133a mRNA水平比較正常對(duì)照組大鼠心臟組織中miR133a mRNA水平〔(2.85±1.07)%〕明顯高于模型組〔(1.21±0.64)%〕(P<0.05)；卡托普利組、TFBFL高、低劑量組治療后miR133a mRNA水平明顯升高分別為(24.87±6.87)%、(4.78±1.49)%、(112.14±4.57)%，與正常對(duì)照組相比較差異顯著(P<0.05)，并以TFBFL低劑量組大鼠升高最為顯著。見圖1。

1正常對(duì)照組，2模型組，3TFBFL高劑量組，4卡托普利組，5 TFBFL低劑量組圖1　五組大鼠心臟組織miR133a 表達(dá)水平的變化

2.3五組大鼠主動(dòng)脈血清BNP水平比較正常對(duì)照組大鼠動(dòng)脈血清中BNP含量〔(15.6±3.67)ng/ml〕明顯低于模型〔(45.34±8.74)ng/ml〕(P<0.01)；卡托普利組、TFBFL高、低劑量組〔(18.75±3.48)ng/ml、(29.85±5.64)ng/ml、(27.94±4.67)ng/ml〕與模型組相比明顯下降(P<0.01)，但三組間無差異(P>0.05)；TFBFL低劑量組大鼠動(dòng)脈血清中BNP含量與TFBFL高劑量組相比較低，但無差異(P>0.05)。

3討論

心力衰竭病情危重、預(yù)后差，是心血管疾病的主要死亡原因，嚴(yán)重威脅人類生命健康〔3〕。本病主要因原發(fā)性心肌損害及心臟負(fù)荷過重為主要基本病因，以呼吸道感染、心律失常為主要誘因〔4〕。阿霉素是臨床上常用的廣譜抗腫瘤藥物，廣泛用于對(duì)實(shí)質(zhì)性以及血液性惡性腫瘤的治療，但阿霉素具有嚴(yán)重的心肌毒性，能夠引起充血性心力衰竭〔5〕。

miR是一類大小為19～25個(gè)堿基內(nèi)源性非編碼RNA，調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄，在心血管系統(tǒng)的生理和病理作用有著重要的地位〔6〕，研究表明〔7〕，通過miR133a的表達(dá)具有心肌組織特異性，對(duì)心力衰竭具有有效的保護(hù)作用。正常情況下〔8〕，BNP主要存儲(chǔ)于心室肌內(nèi)，具有擴(kuò)張血管、增加排鈉、對(duì)抗腎上腺素、腎素-血管緊張素等引起的水、鈉潴留的作用，其分泌量隨著心室充盈壓高低變化，當(dāng)心室充盈壓升高時(shí)，BNP的分泌迅速增加，從而保證心室的搏出量，保證機(jī)體的血氧供應(yīng)量。當(dāng)心力衰竭時(shí)，心室壁張力增加，心室肌應(yīng)激性增加對(duì)BNP分泌，從而導(dǎo)致外周血中BNP含量增加，并且其增高的程度與心衰的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，因此血中BNP常常用來評(píng)價(jià)心衰的進(jìn)程以及判斷預(yù)后的指標(biāo)〔9〕。本研究結(jié)果也證實(shí)了上述理論觀點(diǎn)。

黃酮類化合物是以兩個(gè)酚羥基的苯環(huán)通過中央三碳原子連接而成的一系列化合物，常常連接有酚羥基、甲氧基等功能團(tuán)。從蕎麥花葉中提取出來的總黃酮是一種很強(qiáng)的抗氧化劑，能夠有效清除氧自由基，防止細(xì)胞退化，能夠改善血液循環(huán)，降低血膽固醇含量，具有擴(kuò)張血管、防止血栓形成，有效降低心臟前后負(fù)荷，預(yù)防和有效治療心力衰竭〔10〕?？ㄍ衅绽麨檠芫o張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑，是臨床中治療心力衰竭的標(biāo)準(zhǔn)用藥〔11〕。本研究結(jié)果說明TFBFL能夠上調(diào)心力衰竭大鼠心臟組織miR133a的表達(dá)，對(duì)心力衰竭起到保護(hù)性作用，改善心肌功能，降低水、鈉潴留和心臟負(fù)荷，增加EF及FS，這可能與下調(diào)心室肌對(duì)BNP的分泌有關(guān)〔12〕。雖然低劑量的TFBFL能夠顯著升高心衰大鼠心臟組織miR133a表達(dá)，但心功能指標(biāo)的改善程度與TFBFL的劑量無明顯的量效關(guān)系。

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〔2015-03-28修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

〔中圖分類號(hào)〕R54

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)22-6354-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.016