曾昭定　戴愛國　蔣永亮

(永州市中心醫(yī)院，湖南　永州　425000)

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老齡大鼠呼吸系統(tǒng)病理和生理學變化

曾昭定戴愛國1蔣永亮1

(永州市中心醫(yī)院，湖南永州425000)

〔摘要〕目的探討老齡SD大鼠呼吸系統(tǒng)病理和生理學變化。方法隨機將SD雄性大鼠分為成年組(6月齡)和老齡組(18月齡)，每組各20只，檢測其肺功能，肺系數(shù)(肺重量/體重)，肺組織病理生理改變以及支氣管肺泡灌洗液(BLAF)細胞計數(shù)。結果大鼠肺功能檢測，老齡組與成年組大鼠相比，呼氣峰流量(PEF)、第0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3)及FEV0.3/用力肺活量(FVC)(%)均有所降低(P<0.01)；對成年組、老齡組大鼠體重、肺臟重量及肺臟系數(shù)進行兩兩比較結果顯示不同月齡大鼠體重及肺臟重量具有極顯著性差異(P<0.00)，而肺系數(shù)則無統(tǒng)計學差異(P≥0.05)；肺組織病理生理觀察，老齡組與成年組大鼠比較老齡大鼠肺臟存在生理性老化和退行性變，并且炎癥細胞浸潤增加；支氣管肺泡灌洗液細胞計數(shù)，老齡組白細胞總數(shù)及中性粒細胞數(shù)顯著高于成年組(P<0.00)。結論從呼吸系統(tǒng)病理和生理學方面觀察18月齡大鼠已經(jīng)處于老齡階段。

〔關鍵詞〕老齡；肺功能；肺系數(shù)；病理改變；生理改變；支氣管肺泡灌洗液

1湖南省老年醫(yī)院湖南省老年醫(yī)學研究所呼吸疾病研究室

第一作者：曾昭定(1986-)，男，碩士，主要從事老年慢性阻塞性肺疾病的研究。

我國人口老齡化加速發(fā)展，高齡化趨勢日益加劇〔1〕，據(jù)推算65歲及以上老年人口占總人口的比例將從2000年的7．0%上升到2050年的30．4%〔2〕。因此，爭取健康老齡化與老年保健及抗衰老成為目前研究的熱點和焦點。然而，很多實驗研究從倫理學角度不可能直接在人體進行，所以實驗動物在生命科學、醫(yī)學研究和發(fā)展中起著關鍵性的作用。SD大鼠是目前我國藥物非臨床研究中常用的實驗動物，其特點為頭部狹長，尾長接近身長，產(chǎn)仔多，生長發(fā)育快，抗病能力強(尤以對呼吸系統(tǒng)疾病的抵抗力強)，自發(fā)腫瘤發(fā)生率較低，常用于營養(yǎng)學、內(nèi)分泌學和毒理學等研究〔3〕。然而，目前國內(nèi)對“老齡大鼠”這一概念沒有統(tǒng)一的標準，有的認為14～16月齡為老齡大鼠〔4〕，而有的學者認為18～20月齡為老齡大鼠〔5〕，也有報道24月齡甚至更大月齡才稱為老齡大鼠〔6〕。目前已經(jīng)有很多對SD大鼠生長發(fā)育指標和主要臟器正常參考值的研究報道〔7，8〕，而國內(nèi)對老齡大鼠呼吸系統(tǒng)病理和生理學變化的報道較少。因此，本實驗從呼吸系統(tǒng)病理和生理學角度對成年組和老齡組SD雄性大鼠的體重及肺部各項指標進行測定，旨在為今后老齡大鼠呼吸系統(tǒng)的研究提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1實驗動物SPF級SD雄性大鼠40只(6月、18月齡各20只)，由長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務部提供，合格證號：NO.43006700001049。

1.2飼養(yǎng)條件及儀器飼養(yǎng)在SPF屏障系統(tǒng)中，室溫20℃～25℃，相對濕度51%～67%左右，照明12 h明亮，12 h黑暗。飲水：自來水過濾滅菌，置于高壓滅菌的飲水瓶中自由飲用。飼料：由長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務部提供全價顆粒飼料。主要儀器：小動物肺功能儀(美國BUXCO公司)，DHX75-B小動物呼吸機(成都儀器廠)，Maclab數(shù)據(jù)記錄分析系統(tǒng)(美國BUXCO公司)，PB602-s型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，普通光學顯微鏡(上海光學儀器廠)，低溫高速離心機(美國Beckman公司)，微量移液槍(德國Eppendorf公司)。

1.3實驗方法

1.3.1大鼠肺功能測定在中南大學醫(yī)學機能實驗教學中心進行大鼠肺功能測定：以1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，分離氣管做V型切口，插入Y形管，Y形管兩端分別與流速、壓力傳感器相連，流速傳感器對應端與小動物呼吸機連接。設置潮氣量為10 ml/kg,呼吸頻率為60次/min。將流速、壓力傳感器分別與Maclab數(shù)據(jù)記錄分析系統(tǒng)連接。在描記一段平靜呼吸后，在呼氣末以注射器經(jīng)三通管迅速以相當于潮氣量5倍的氣量充氣(相當于深吸氣)，然后立即脫開，連接負壓(-25 cmH2O)抽氣造成深吸氣，所引起的容積變化經(jīng)微機處理計算出PEF、FEV0.3、FEV0.3/FVC。

1.3.2肺臟稱重及肺臟系數(shù)測定以1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠腹主動脈放血處死(解剖前禁食12 h，不禁水)，取出肺臟后立即稱重(肺臟稱重前將其周圍脂肪組織和結締組織等剔除，并用濾紙吸去肺臟表面的血液及體液)，肺臟系數(shù)=肺重(g)/體重(100 g)。

1.3.3大鼠肺組織病理學觀察測完肺功能后，2 h內(nèi)將大鼠腹主動脈放血處死，開胸夾閉除右肺中葉以外的所有肺葉，于右肺中葉灌注4%多聚甲醛(含1‰DEPC水)1～2 ml結扎，取下，置于4%多聚甲醛中固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片，厚度4 μm，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察。

1.3.4支氣管肺泡灌洗液(BALF)細胞計數(shù)及分類用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)進行右心室灌注，去除肺血。開胸夾閉右支氣管，用10 ml生理鹽水，一般為37℃，室溫下(25℃左右)生理鹽水可應用，進行在體肺泡灌洗，緩慢的經(jīng)氣道把生理鹽水注入肺臟至大鼠肺逐漸變得膨脹、蒼白、至出現(xiàn)阻力，再回抽液體，如此反復進行3次，最終回收量約8 ml左右，回收率為75%～85%左右。灌洗液做細胞計數(shù)和分類計數(shù)，將BALF 1 500 r/min離心10 min，沉渣定量稀釋重懸后計數(shù)細胞。取BALF沉渣稀釋液少許，涂片，瑞氏染色作中性粒細胞計數(shù)。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0軟件行t檢驗。

2結果

2.1大鼠外觀及體重比較成年組大鼠毛發(fā)順滑，有光澤，神情活潑，體重(380.36±13.02)g；老齡組大鼠毛蓬亂少光澤，顯得遲鈍少動，反應緩慢，缺少靈敏性，體重(592.38±38.71)g。

2.2大鼠肺功能比較與成年組大鼠相比，老齡組大鼠PEF、FEV0.3及FEV0.3/FVC均有降低(P<0.01)。見表1。

表1　不同月齡SD雄性大鼠肺功能比較

2.3病理形態(tài)觀察

2.3.1肺大體形態(tài)觀察成年組大鼠肺表面光滑平整，無出血及滲出物，呈淡粉紅色，大小正常，質(zhì)地均勻，彈性適當；老齡組大鼠肺表面欠光滑，肺組織色澤灰暗，觸摸肺呈棉花樣感，甚至局部出現(xiàn)粘連。

2.3.2肺臟稱重及肺臟系數(shù)測定兩組大鼠體重及肺臟重量具有極顯著性差異(P<0.00)，而肺系數(shù)則無差異(P>0.05)。見表2。

表2　不同月齡SD雄性大鼠體重、肺重及

2.3.3光鏡觀察成年組肺組織結構清晰，肺泡壁薄，大鼠肺泡結果完整，肺泡腔及間質(zhì)隙內(nèi)未見出血、水腫，各級支氣管壁有少量炎性細胞浸潤，中層平滑肌未增厚，氣道未見狹窄，未見明顯的肺泡腔擴大及肺大泡的形成，肺泡隔血管無充血、淤血，支氣管纖毛排列整齊。老齡組大鼠與成年組大鼠相比肺組織結構欠清晰，各級支氣管壁有更多的炎癥細胞浸潤，可見部分肺泡腔擴大及肺大泡形成，其余則與成年組大鼠沒有多大差別。見圖1。

圖1　不同月齡SD雄性大鼠肺組織HE染色比較(×100)

2.4BALF細胞計數(shù)及分類老齡組大鼠白細胞總數(shù)及中性粒細胞數(shù)顯著高于成年組(P≤0.00)，見表3。

表3　不同月齡SD雄性大鼠BALF

3討論

隨著年齡的增長，人體各系統(tǒng)的器官結構會出現(xiàn)相應的老化，并伴隨器官功能的減退，而呼吸系統(tǒng)的改變尤為顯著。同樣，大鼠各器官隨著增齡也出現(xiàn)類似的老化。大鼠的肺臟在經(jīng)歷生長期和發(fā)育期之后，即開始隨著增齡出現(xiàn)結構和形態(tài)的改變及其功能的進行性減退。

肺功能檢查能夠提供重要的臨床信息，可以確定并量化呼吸系統(tǒng)功能的缺陷和異常，有助于判斷有無通氣功能障礙，以及障礙的性質(zhì)和程度，可以作為某些肺疾患診斷的輔助手段。本實驗說明大鼠隨著年齡增加，小氣道阻力也相應增加，存在一定的氣流受限、阻塞性肺通氣功能障礙。本文推測這些功能改變與呼吸系統(tǒng)結構變化有關，可能是隨著增齡其胸壁順應性及肺彈性回縮力下降、呼吸肌動力作用降低等導致的。同時，我們觀察老齡組SD雄性大鼠在增齡過程中肺功能儲備能力降低的更為明顯，說明18月齡大鼠已經(jīng)處于老齡階段。

已知肺是具有彈性的海綿狀器官，肺泡腔增大，肺泡壁變薄，呼吸膜內(nèi)的基膜增厚是肺衰老的典型特征，即“老年肺”。 我們通過觀察發(fā)現(xiàn)18月齡大鼠的肺組織形態(tài)基本符合“老年肺”的特征〔9〕。臟器系數(shù)常能反映實驗動物的營養(yǎng)狀態(tài)和內(nèi)臟的病變情況。動物的臟器系數(shù)會受到物種，性別，年齡和環(huán)境的影響，可見它是一個非常重要的觀察指標。本實驗說明肺臟重量與體重比值并不隨著年齡增長而增加。這一結果與王堯等〔8～10〕的研究相一致，而老齡組大鼠肺臟重量及肺系數(shù)與練有文等〔11〕研究的結果有一定的差異。

本實驗結果提示老齡大鼠肺臟存在生理性老化和退行性變，這與馬佳等〔12〕研究的結果相一致。而且，老齡大鼠肺泡管和肺泡腔擴大更加明顯，我們推測是由于隨著年齡的增長呼吸細支氣管和肺泡區(qū)的部分彈性纖維退化、斷裂和盤繞有關。本實驗推測大鼠肺臟隨著年齡的增加，特別是進入老年階段可能引起功能低下，從而導致炎癥細胞增加。

綜上所述，不同SD大鼠其全身各項指標會存在不同程度的差異，特別是隨著年齡的增加其全身指標的變化更加明顯。本實驗結果表明18月齡SD大鼠已經(jīng)處于老齡階段，其肺部病理生理改變符合老齡大鼠標準。

4參考文獻

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11練有文，鐘康銀，黎石富，等.SPF級18月齡SD大鼠臟器重量、臟器系數(shù)的測定〔R〕.廣州：第七屆中南地區(qū)實驗動物科技交流會，2007.

12馬佳，張代輝，王鵬.正常SPF級SD大鼠組織病理學背景數(shù)據(jù)庫的建立〔C〕.北京：2006年全國藥物毒理學會議論文集，2006.

〔2014-03-07修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

通訊作者：戴愛國(1966-)，男，教授，博士后，碩士生導師，主要從事肺動脈高壓研究。

基金項目：湖南省科技計劃項目(2011FJ6048)

〔中圖分類號〕R363

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6341-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.010