楊 婷，廖美德，賀玉廣，劉偲嘉

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642）

（Key Laboratory of Natural Pesticide Chemical Biology,Ministry of Education,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China）

枯草芽孢桿菌固體發(fā)酵條件優(yōu)化

楊 婷，廖美德*，賀玉廣，劉偲嘉

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642）

為研究初始pH、蛋白胨濃度和不同發(fā)酵底物對枯草芽孢桿菌生長的影響，對不同發(fā)酵底物進(jìn)行液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH為6.5～7.0時，細(xì)菌生長最快，pH為7.5～8.0時，蛋白酶的活性最強(qiáng)；蛋白胨1.6 g·L-1的LB培養(yǎng)基，枯草芽孢桿菌的生長狀況最好，蛋白酶的活力也最強(qiáng)；豆粕是優(yōu)質(zhì)氮源，能顯著促進(jìn)枯草芽孢桿菌的生長和蛋白酶活性，豆粕20%、豆渣10%、麩皮60%和玉米粉30%作為固態(tài)發(fā)酵底物，枯草芽孢桿菌的生長速度最快，豆粕10%、豆渣10%、麩皮50%和玉米粉10%為固態(tài)發(fā)酵底物，枯草芽孢桿菌分泌的蛋白酶活力最強(qiáng)。

枯草芽孢桿菌；發(fā)酵；正交實(shí)驗(yàn)

（Key Laboratory of Natural Pesticide Chemical Biology,Ministry of Education,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China）

枯草芽孢桿菌是一類廣泛分布于各種不同生活環(huán)境中的革蘭氏陽性好氧型細(xì)菌，常作為益生菌添加在幼小動物日糧中，能夠起到改善動物腸道菌群結(jié)構(gòu)、提高消化酶活性、改善機(jī)體免疫功能以及提高生產(chǎn)性能的作用，對人畜無毒害作用，不污染環(huán)境[1-2]。枯草芽孢桿菌可產(chǎn)生蛋白酶、α-淀粉酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶和木聚糖酶等，對提高動物的飼料轉(zhuǎn)化率、促進(jìn)營養(yǎng)的消化吸收和預(yù)防疾病起到重要作用[3-5]。目前，在工業(yè)化生產(chǎn)中，仍然存在發(fā)酵周期長、芽孢形成率低、成本高等問題。本文在前人的研究基礎(chǔ)上，以玉米粉、麩皮、豆粕、豆渣為原料，旨在尋找出一種高效經(jīng)濟(jì)的發(fā)酵底物，獲得較高的枯草芽孢桿菌產(chǎn)量和酸性蛋白酶活力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種為枯草芽孢桿菌，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室保存；豆粕、豆渣和玉米粉均購買于廣州市花鳥魚蟲市場。

培養(yǎng)基的制備。液體LB培養(yǎng)基：蛋白胨1 g、氯化鈉1 g、酵母粉0.5 g、蒸餾水100 mL；固體LB培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基+2%的瓊脂粉，121℃，滅菌20 min，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 初始pH對細(xì)菌生長和蛋白酶活性的影響

設(shè)置初始pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的液體LB培養(yǎng)基，每組設(shè)6組重復(fù)，2%的接種量接入枯草芽孢桿菌菌種，180 rpm恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)液稀釋10倍測OD600。菌液5 000 rpm離心10 min，除去菌體，取上清液待用。用移液槍吸取上清液0.5 mL，注入奶粉-瓊脂雙層平板的點(diǎn)樣孔之中，放置4和8 h后測量水解圈的大小，測定其蛋白酶活性。

1.2.2 蛋白胨對細(xì)菌生長和蛋白酶活性的影響

以液體LB培養(yǎng)基（蛋白胨濃度為10 g·L-1）為對照組，不同濃度蛋白胨的LB培養(yǎng)基為處理組，蛋白胨濃度設(shè)為12、14、16、18和20 g·L-1，每組設(shè)6個重復(fù)，試驗(yàn)操作同1.2.1。

1.2.3 豆粕、豆渣和玉米粉對枯草芽孢桿菌生長的影響

配制豆粕（豆渣、玉米粉和麩皮）培養(yǎng)基（固體∶水=1∶20），混合均勻，121℃，滅菌20 min，備用。液體LB培養(yǎng)基，每組設(shè)6個重復(fù)，試驗(yàn)操作同1.2.1，稱取1 g發(fā)酵物用平板稀釋法計算活菌數(shù)。

1.2.4 單因素正交實(shí)驗(yàn)

枯草芽孢桿菌發(fā)酵底物正交實(shí)驗(yàn)的因子與水平見表1。按照表1配制固體培養(yǎng)基，料水比為1∶1，加入1%氯化鈉，攪拌均勻，121℃，滅菌20 min，備用。接種量V/M（V-液體種子體積數(shù)，M-固體發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量）為2%。常溫發(fā)酵24 h后，稱取 發(fā)酵物1 g，用平板稀釋法計算活菌數(shù)。按照福林-酚試劑法測定蛋白酶活力。

表1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵底物正交實(shí)驗(yàn)的因子與水平 %

1.3 統(tǒng)計分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Dps 7.05軟件進(jìn)行顯著性分析，并采用Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始pH對細(xì)菌生長和蛋白酶活性的影響

初始pH對細(xì)菌生長和蛋白酶活性的影響見表2。

表2 pH對細(xì)菌生長和蛋白酶活力的影響

由表2可知，不同初始pH對細(xì)菌生長和蛋白酶活性有一定的影響，在pH約6.5時細(xì)菌的生長速度最快，但蛋白酶活性最強(qiáng)時的pH為7.45。

2.2 蛋白胨對細(xì)菌生長和蛋白酶活性的影響

蛋白胨濃度對枯草芽孢桿菌生長和蛋白酶活性的影響見表3。

表3 蛋白胨濃度對枯草芽孢桿菌生長和蛋白酶活性的影響

由表3可知，蛋白胨16 g·L-1處理組較對照組細(xì)菌生長速度和蛋白酶活力都最好，差異顯著（P＜0.05）。

2.3 不同培養(yǎng)基對細(xì)菌生長和蛋白酶活性的影響

豆粕、豆渣、玉米粉對枯草芽孢桿菌生長和蛋白酶活性的影響見表4。

表4 豆粕、豆渣、玉米粉對枯草芽孢桿菌生長和蛋白酶活性的影響

由表4可知，豆粕不僅是優(yōu)質(zhì)氮源，能顯著促進(jìn)枯草芽孢桿菌的生長（P＜0.05），同時對其蛋白酶活性影響更大。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)

2.4.1 血球計數(shù)板測定枯草芽孢桿菌活菌數(shù)

活菌數(shù)正交分析表見表5。

表5 活菌數(shù)正交分析

從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，影響細(xì)菌生長的主要因素影響力排列為麩皮＞豆粕＞玉米粉＞豆渣，最適培養(yǎng)基為豆粕10%、豆渣20%、麩皮60%、玉米粉20%。

2.4.2 蛋白酶活力測定結(jié)果

蛋白酶活力正交分析見表6。

由表6可知，影響酶活力的主要因素影響力為豆粕＞豆渣＞麩皮≈玉米粉，最適培養(yǎng)基為豆粕10%、豆渣10%、麩皮50%、玉米粉10%的酶活力達(dá)到最佳。

表6 蛋白酶活力正交分析

3 討論

枯草芽孢桿菌作為益生菌微生態(tài)制劑因其綠色、安全受到了畜牧工作者的推崇。優(yōu)良的微生態(tài)制劑必須有足夠的活菌數(shù)量，為了盡量提高產(chǎn)品芽孢的數(shù)量,需要對其產(chǎn)芽孢的培養(yǎng)基進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化,以降低生產(chǎn)成本,提高芽孢得率[6-7]。

種子培養(yǎng)基是供菌體生長繁殖用的，營養(yǎng)成分應(yīng)易被菌體吸收利用，要較豐富和完整，其中氮源和維生素的含量應(yīng)略高些，但總濃度略低為宜，以便菌體的生長繁殖。發(fā)酵培養(yǎng)基是供菌體生長繁殖和合成大量代謝產(chǎn)物用的，采用的原材料質(zhì)量應(yīng)相對穩(wěn)定，同時不影響產(chǎn)品的質(zhì)量，因此必須按照不同培養(yǎng)階段的微生物生理學(xué)特性提供適宜的培養(yǎng)基配方[8-9]?？莶菅挎邨U菌在種子培養(yǎng)過程中，試驗(yàn)中初始pH為6.5～7.0，細(xì)菌的生長速度是最快的；pH為7.5～8.0時，蛋白酶的活性最強(qiáng)；試驗(yàn)中蛋白胨16 g·L-1的培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌的生長最佳，并且蛋白酶的活力也最強(qiáng)。

碳源是組成培養(yǎng)基的主要成分之一，其主要作用是供給菌種生命活動所需要的能量和構(gòu)成菌體細(xì)胞成分和代謝產(chǎn)物中的碳素來源，目前，世界上主要選用玉米粉作為枯草芽孢桿菌發(fā)酵的碳源[10]。氮源作為枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的另一個主要因素，在芽孢的形成上也發(fā)揮著重要作用，枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)中常用豆餅粉作氮源[11]。C/N直接影響菌體的生長和代謝，過高過低都影響細(xì)菌的生長和產(chǎn)物的合成[12]。本試驗(yàn)選用豆粕、豆渣、麩皮和玉米粉為發(fā)酵底物，結(jié)果表明，固體培養(yǎng)基中的麩皮含量對枯草芽孢桿菌的生長速度影響最大，以豆粕20%、豆渣10%、麩皮60%、玉米粉30%的固體培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌的生長速度最快；固體培養(yǎng)基中豆粕含量對枯草芽孢桿菌分泌的蛋白酶活力影響最大，以豆粕10%、豆渣10%、麩皮50%、玉米粉10%的固體培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌分泌的蛋白酶活力最強(qiáng)。

[1] 王曉閣.枯草芽孢桿菌研究進(jìn)展與展望[J].中山大學(xué)研究生學(xué)刊（自然科學(xué)、醫(yī)學(xué)版）,2012,33（3）:14-23.

[2]羅會玲,黎相廣,張百贇,等.枯草芽孢桿菌在魚類生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].飼料博覽,2014（11）:38-41.

[3]袁小平,王靜,姚惠源,等.枯草芽孢桿菌內(nèi)切木聚糖酶的純化與性質(zhì)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2004,30（8）:55-59.

[4]周映華,吳勝蓮,賀月林,等.飼用枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2010（11）:21-23.

[5]李研東.動物微生態(tài)制劑的使用現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[J].河北畜牧獸醫(yī),2005,21（4）:48-50.

[6] Guo X,Li D,Lu W,et al.Screening of Bacillus strains as potential probiotics and subsequent confirmation of the in vivo effectiveness of Bacillus subtilis MA139 in pigs[J].Antonie Van Leeuwenhoek,2006,90（2）:139-146.

[7] 張麗霞.枯草芽孢桿菌B908發(fā)酵工藝優(yōu)化研究[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[8] 何健勇.發(fā)酵工藝學(xué)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2009.

[9] 趙春海,闞振榮,安衛(wèi)紅,等.α-乙酰乳酸脫羧酶產(chǎn)生菌發(fā)酵培養(yǎng)基碳源與氮源的優(yōu)化[J].河北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）, 2005,25（3）:313-317.

[10] 錢銘鏞.發(fā)酵工程最優(yōu)化控制[M].江蘇:科學(xué)技術(shù)出版社, 1998.

[11]張云波,孫謐,王躍軍,等.黃海黃桿菌YS-9412-130產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].海洋水產(chǎn)研究,2000,21（4）:26-35.

[12] 郭小華,陸文清,鄧萍,等.益生枯草芽孢桿菌MA 139增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2006,11（3）:41-46.

Optimization of Solid-state Fermentation ofBacillus Subtilis

YANG Ting,LIAO Meide*,HE Yuguang,LIU Sijia

To study the effects of the initial pH,peptone concentration and different fermentation substrate on the growth of bacillus subtilis.For different fermentation substrate,liquid and solid state fermentation experiment was carried out.The result showed that the pH at the range of 6.5 to 7.0 made the bacteria grow fast,and pH 7.5 to 8.0 was better to protease activity.The bran content of the solid medium was the main factor for the bacillus subtilis growth,while 20%soybean meal,10%okara,60%wheat bran and 30%corn flour were the best substrate for bacillus subtilis growth;soybean played an important role on the activity of protease,while 10%soybean meal,10%okara,50%wheat bran and 10%corn flour as a fermentation substrate,the activity of protease would be strongest.

bacillus subtilis;fermentation;orthogonal test

S816.6

A

1001-0084（2015）03-0005-04

2015-01-27

廣州市科技局項(xiàng)目（2008J1-C221）

楊婷（1990-），女，湖北孝感人，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锎x產(chǎn)物。

*通訊作者：副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail:meideliaotg@163.com。