NF-κB參與銀杏葉提取物保護血管內(nèi)皮細胞的作用

趙外歐李相軍1

(吉林大學第一醫(yī)院心血管中心，吉林長春130021)

摘要〔〕目的闡明銀杏葉提取物(GBE)對H2O2介導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)損傷的保護作用。方法HUVEC分為對照組、H2O2處理組、50 mg/L及100 mg/L GBE處理組。用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測各組細胞增殖能力。Western印跡分析各組細胞(NF-κB P65)表達。結(jié)果H2O2處理組細胞增殖率明顯低于對照組(P<0.01)；GBE高、低劑量組細胞增殖能力明顯高于H2O2處理組(P<0.01，P<0.05)。各組細胞細胞核NF-κB P65表達量差異有顯著性，與H2O2處理組比較，GBE高、低劑量組NF-κB P65核/漿比明顯升高(P<0.01)。結(jié)論GBE通過NF-κB通路影響血管內(nèi)皮細胞的增殖能力。

關(guān)鍵詞〔〕銀杏葉提取物；血管內(nèi)皮細胞；NF-κB；細胞增殖

中圖分類號〔〕R285〔

通訊作者：李相軍(1974-)，男，醫(yī)學博士，講師，主要從事心血管藥理研究。

1吉林大學藥學院實驗藥理與毒理教研室

第一作者：趙外歐(1971-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事冠心病基礎研究。

銀杏葉提取物(GBE)已被廣泛應用于心、腦血管疾病的預防和治療〔1，2〕。NF-κB作為調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄的核蛋白因子，廣泛存在于多種細胞內(nèi)，參與炎癥、免疫、細胞增殖和凋亡等病理生理過程的基因調(diào)控，研究表明NF-κB 在血管內(nèi)皮細胞氧化應激過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用〔3，4〕。GBE藥理作用廣泛，有研究表明，GBE有保護血管內(nèi)皮細胞作用〔5〕，但其機制尚不清楚。本研究旨在通過利用H2O2介導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)損傷模型，探討GBE在此過程中對內(nèi)皮細胞的保護作用，同時探討NF-κB在其中的作用。

1材料與方法

1.1細胞株及主要試劑HUVEC細胞株為本實驗室保留。GBE，商品名為金納多，購自德國威瑪舒培博士大藥廠。DMEM培養(yǎng)基及新生牛血清購自Hyclone公司。NF-κBp65(F-6)(SC-8008)購自SantaCruz Biotechnology，HRP標記的山羊抗小鼠IgG(ZB-2305)購自北京中杉金橋公司?；瘜W發(fā)光試劑盒(ECL)為美國Millipore公司產(chǎn)品。細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒(P0013B)為廣東碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.2實驗分組HUVEC細胞株經(jīng)常規(guī)復蘇、傳代培養(yǎng)至對數(shù)期后，按下述條件分為4組，對照組、H2O2處理組、50 mg/L(低劑量)及100 mg/L(高劑量)GBE組。其中正常對照組用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；H2O2處理組用含500 μmol/L H2O2的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；50 mg/L及100 mg/L GBE處理組在H2O2處理組所用培養(yǎng)基基礎上加入GBE至終濃度分別為50 mg/L和100 mg/L。各組細胞換用上述條件培養(yǎng)液之前，先用無血清培養(yǎng)液預處理12 h，以使HUVEC生長同步化。HUVEC常規(guī)傳代培養(yǎng)用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.3細胞增殖能力測定采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法。將處于對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，接種密度為1×103/孔，待細胞完全貼壁后，換用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h以同步化細胞生長，然后換用上述條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，第2天，向每孔中加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，3 h后，棄去培養(yǎng)上清，加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO)以溶解沉淀，于490 nm處用酶標儀測定各孔吸光度值(OD)。計算各組細胞增殖率。每組設5個復孔，重復3次。

1.4細胞核蛋白與細胞質(zhì)蛋白的抽提核質(zhì)總蛋白提取主要操作步驟：將貼壁生長的HUVEC用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1遍，用細胞刮子刮下細胞，離心收集細胞，盡最大努力吸盡上清，每20 μl細胞沉淀加入200 μl添加了PMSF的細胞質(zhì)蛋白抽提試劑A。劇烈渦旋振蕩5 s，把細胞沉淀完全懸浮并分散開，冰浴10～15 min。再加入細胞質(zhì)蛋白抽提試劑B 10 μl，劇烈渦旋振蕩5 s，冰浴1 min。4℃ 12 000 r/min離心5 min，上清為抽提得到的細胞質(zhì)蛋白。對于沉淀，加入50 μl添加了PMSF的細胞核蛋白抽提試劑，劇烈渦旋振蕩5 s，把細胞沉淀完全懸浮并分散開。然后放回冰浴中，每隔1～2 min再劇烈渦旋振蕩15～30 s，共30 min。4℃ 12 000 r/min離心10 min，上清為抽提得到的細胞核蛋白。

1.5Western印跡分析用Western印跡分析各組培養(yǎng)細胞胞漿與胞核中NF-κBp65表達情況。采用Bradford法測定各樣本總蛋白濃度。將蛋白樣品30 μg與上樣緩沖液混勻，加熱、變性后按標準程序進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜。將蛋白膜漂洗后加入5%脫脂奶粉封閉液，再加入適當比例(1∶200)稀釋的NF-κB，4℃孵育過夜。TBST洗液洗膜3次，5 min/次，立即加入稀釋好的HRP標記山羊抗小鼠IgG，室溫孵育1 h。TBST洗液洗膜3次，5 min/次。用ECL發(fā)光顯色試劑盒顯色，顯影、定影，掃描底片后用Image J軟件分析條光密度。以比較細胞核及細胞質(zhì)NF-κB條帶密度，分析NF-κB在各組細胞中的變化情況。

2結(jié)果

2.1MTT結(jié)果以對照組細胞活力為100%，H2O2處理組細胞增殖率為73.91%(73.91%±8.77%)，明顯低于對照組(P<0.01)。GBE高、低劑量組細胞增殖能力〔(94.43±10.81)%、(87.29±8.34)%〕明顯高于H2O2組〔(73.91±8.77)%〕(P<0.01、P<0.05)。

2.2Western印跡結(jié)果各組細胞胞質(zhì)中NF-κB p65表達量差異無顯著性，而各組細胞NF-κB P65在細胞核中表達量差異有顯著性。H2O2處理組NF-κB P65核/質(zhì)比值(0.78±0.21)與對照組(1.99±0.40)比較差異顯著(P<0.05)。與H2O2處理組比較，GBE高、低劑量組(1.55±0.31,1.43±0.19)明顯升高(P<0.01)，見圖1。

1～4：對照組、H 2O 2處理組、GBE高、低劑量組 圖1　各組細胞細胞質(zhì)及細胞核NF-κB P65表達

3討論

H2O2是體內(nèi)常見的一種活性氧，作為氧化應激反應的伴隨產(chǎn)物，可促進自由基生成。H2O2很易穿透細胞膜到達胞內(nèi)改變細胞內(nèi)生理微環(huán)境，因此積累到一定程度會造成細胞損傷〔6〕。血管內(nèi)皮細胞的損傷是多種血管性病變的主要環(huán)節(jié)，保護血管內(nèi)皮功能成為防治血管性疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。H2O2引起細胞損傷的濃度各有不同〔7，8〕，本研究表明用500 μmol/L H2O2能夠抑制HUVEC增殖。

NF-κB是一種核蛋白因子，廣泛存在于多種細胞內(nèi)，參與炎癥、免疫、細胞增殖和凋亡等病理生理過程的基因調(diào)控。靜息狀態(tài)下，NF-κB以p50/p65 二聚體形式存在于細胞質(zhì)內(nèi)，抑制性蛋白(IκB)結(jié)合，結(jié)合狀態(tài)下NF-κB沒有活性。當存在病毒、氧化劑、炎癥細胞因子等刺激時，IκB被IκBa激酶等蛋白激酶激活而降解，隨之NF-κB即被釋放激活，解離后的p50/p65轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，與基因啟動子上的κB序列結(jié)合，啟動有關(guān)基因的表達與調(diào)控〔9〕。NF-κB蛋白本身存在于胞質(zhì)中，所以由其調(diào)控免疫反應更快捷有效，因此NF-κB被認為是控制早期基因表達的基因開關(guān)〔10〕。本研究提示H2O2對HUVEC的抑增殖作用與降低NF-κB P65遷移入核、進而抑制轉(zhuǎn)錄有關(guān)。GBE可顯著增加由H2O2介導HUVEC損傷細胞核NF-κB P65表達量，提高核質(zhì)比例，增加細胞轉(zhuǎn)錄活性，刺激HUVEC操作修復，細胞增殖，從而實現(xiàn)對HUVEC的保護作用。

4參考文獻

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9Verhelst K，Verstrepen L，Carpentier I，etal.IκB kinase ε (IKKε)：a therapeutic target in inflammation and cancer〔J〕.Biochem Pharmacol，2013；85(7)：873-80.

10Oeckinghaus A，Ghosh S.The NF-kappaB family of transcription factors and its regulation〔J〕.Cold Spring Harb Perspect Biol，2009;1(4)：a000034.

〔2013-11-04修回〕

(編輯徐杰)