齊微微，卞輯，蔡興航，郭佩佩，王艷菲，姚宇秀，于國萍

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030）

0 引言

近年來人們對乳清蛋白肽[1]的研究逐漸成為熱點(diǎn)，目前已發(fā)現(xiàn)某些肽段具有抗氧化，降血壓[2]，降膽固醇，增強(qiáng)免疫力，抗毒，抗病菌[3]等多種生理功能，E.A.Pera-Ramos等研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白酶解物在脂質(zhì)氧化體系中可以防止脂質(zhì)過氧化[4]。Tugba Bayr[5]等酶解乳清蛋白，研究了其自由基清除能力，發(fā)現(xiàn)乳清蛋白肽具有良好的抗氧化活性；包怡紅等[6]證實(shí)以全乳清為原料，利用堿性蛋白酶對乳清蛋白進(jìn)行降解，水解后的多肽對Fenion體系產(chǎn)生的羥自由基有清除能力。目前已經(jīng)證實(shí)乳清蛋白肽能夠清除自由基[7]，延緩機(jī)體衰老，因而可能也具有改善學(xué)習(xí)記憶的作用，但研究并不多見。本實(shí)驗(yàn)選擇抗氧化活性最強(qiáng)的乳清蛋白肽的超濾組分進(jìn)行動物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，研究乳清蛋白肽對衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

濃縮乳清蛋白（WPC 80），蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)78.29%，堿性蛋白酶（1.75×105U/g），昆明種雌雄小鼠，吡拉西坦（腦復(fù)康，0.4 g×100片），其余所有試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

UVmini-1240紫外可見分光光度計(jì)，LD4-2A型低速離心機(jī)，萬能粉碎機(jī)，RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，DSM-2型Morris水迷宮系統(tǒng)與SCS-2型程控小鼠穿梭箱，DT-200小鼠跳臺測試儀。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白抗氧化肽的制備

乳清蛋白肽的制備參考卞輯的方法[8],以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，對乳清蛋白肽進(jìn)行脫鹽、超濾分離，篩選出抗氧化活性最高的組分（分子量小于3 ku），將其冷凍干燥成粉末，以備下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 動物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)及分組

動物飼養(yǎng)：取雌雄昆明種小鼠80只，購買自然衰老的老年小鼠16～18月齡，青年小鼠3月齡，體重20.0g±2.0 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，用Morris水迷宮系統(tǒng)篩選，剔除漂在水面上的小鼠，剩余72只。隨機(jī)分組（見表1），每組雌雄小鼠數(shù)目相等，分為青年對照組，老年模型組，腦復(fù)康對照組和乳清蛋白肽低、中、高劑量組，分籠飼養(yǎng)，雌雄不同籠。每組12只，每5天稱1次體質(zhì)量，老年模型組和青年對照組每天注射等量生理鹽水。低、中、高劑量組注射的乳清蛋白肽溶液是由超濾分離出的分子量小于3 ku的寡肽凍干粉配制而成。

表1 動物實(shí)驗(yàn)分組方案

1.3.2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

連續(xù)喂養(yǎng)30 d后，于第31天按照跳臺實(shí)驗(yàn)、穿梭箱實(shí)驗(yàn)、水迷宮實(shí)驗(yàn)的順序依次開始行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

（1）跳臺實(shí)驗(yàn)[9]。實(shí)驗(yàn)時(shí)先將小鼠放入反應(yīng)箱內(nèi)（臺上、臺下）適應(yīng)環(huán)境3 min，然后將其放在銅柵上，立即通以36 V的交流電，觀察小鼠受到電擊跳回平臺以及再次跳至銅柵上的情況。如此訓(xùn)練5 min，記錄每只小鼠受電擊的次數(shù)或稱錯(cuò)誤次數(shù)（EN1），以此作為學(xué)習(xí)成績。24 h后和5 d后分別進(jìn)行重復(fù)測驗(yàn)，將小鼠置于平臺上，記錄各鼠第一次跳下平臺的時(shí)間，即停留潛伏期（step-down latency，SDL）和各鼠3 min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)（EN1），以此作為記憶成績。停止實(shí)驗(yàn)5d后再進(jìn)行1次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，記錄上述指標(biāo)，作為記憶消退階段的成績。

（2）穿梭箱實(shí)驗(yàn)[10-11]。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠放入穿梭箱內(nèi)任何一側(cè)，10 s后開始出現(xiàn)蜂鳴音，持續(xù)5 s，蜂鳴音后給予電刺激（100 V，0.2 mA，50 Hz，AC），持續(xù)10 s。連續(xù)訓(xùn)練4 d，每天10次。記錄以下指標(biāo)：電擊時(shí)間，即動物被電擊的累計(jì)時(shí)間；電擊次數(shù)，即在10個(gè)循環(huán)中小鼠被電擊到的次數(shù)。

（3）Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[12-13]。實(shí)驗(yàn)時(shí)將平臺隨機(jī)置于第一象限并固定于水下1～1.5 cm，水溫保持在21℃±1℃。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分。

①定位航行實(shí)驗(yàn)：用于測量小鼠在水迷宮中的學(xué)習(xí)和記憶能力，實(shí)驗(yàn)歷時(shí)6 d，每天訓(xùn)練4次。在距離平臺所在象限的較遠(yuǎn)象限的水池壁上標(biāo)定一點(diǎn)，作為實(shí)驗(yàn)小鼠的入水點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)過程保持站臺位置和小鼠落水位置不變。將小鼠沿水池壁慢慢放入水中，通過Dig Behv-MWM視頻分析系統(tǒng)記錄小鼠從投入水池至找到并爬上平臺的時(shí)間，此為定向航行實(shí)驗(yàn)逃逸潛伏期，同時(shí)記錄游泳路程、游泳速度和朝向角，以此作為評價(jià)大鼠學(xué)習(xí)能力差異的指標(biāo)，每次觀察時(shí)間為90 s，若設(shè)定時(shí)間內(nèi)未找到站臺，計(jì)算機(jī)停止跟蹤，記錄時(shí)間為90 s，然后通過引導(dǎo)使小鼠游上平臺并停留5s。每次試驗(yàn)均在安靜的環(huán)境中進(jìn)行，水池和光源的位置應(yīng)保持不變。

②空間探索實(shí)驗(yàn)：用于測量小鼠對平臺空間位置的記憶保持能力，方法為第七天撤去平臺，以訓(xùn)練時(shí)的標(biāo)定點(diǎn)作為入水點(diǎn)，將小鼠放入水中，記錄120 s內(nèi)小鼠在目標(biāo)象限（平臺所在象限）的停留時(shí)間、目標(biāo)象限停留路程、準(zhǔn)確穿越平臺所在位置的次數(shù)及初次穿越平臺時(shí)間等指標(biāo)，作為空間搜索試驗(yàn)的成績，以此來判斷小鼠對空間位置的短期記憶和判斷能力。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

文中數(shù)據(jù)均使用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所用數(shù)據(jù)均為三次的平均數(shù)，誤差項(xiàng)為標(biāo)準(zhǔn)誤，單因素方差分析（ANOVA）中采用Duncan檢驗(yàn)。文中采用Sigma Plot 9.0軟件作圖，圖表中標(biāo)有相同字母者為差異不顯著，有不同字母者為差異顯著（P≤0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 跳臺實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果

表2為乳清蛋白肽對跳臺潛伏期和跳臺錯(cuò)誤次數(shù)的影響。由表2可以看出，與老年模型組相比，學(xué)習(xí)5 min后，青年對照組、腦復(fù)康對照組和乳清蛋白肽劑量組錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少；24 h后重復(fù)測驗(yàn)結(jié)果顯示，乳清蛋白肽中、高劑量組的潛伏期顯著增加，錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少，乳清蛋白肽低劑量組的潛伏期無顯著變化，錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少；5 d后重復(fù)測驗(yàn)結(jié)果顯示，乳清蛋白肽中、高劑量組的潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)變化與24 h相同，而低劑量組的潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)均無顯著變化。與青年對照組和腦復(fù)康對照組相比，學(xué)習(xí)5 min后，乳清蛋白肽劑量組的錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加；24 h后重復(fù)測驗(yàn)結(jié)果顯示，乳清蛋白肽劑量組的潛伏期顯著減少，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加；5 d后重復(fù)測驗(yàn)結(jié)果與24 h變化規(guī)律一樣。

表2 乳清蛋白肽對跳臺潛伏期和跳臺錯(cuò)誤次數(shù)的影響（n=10）

結(jié)果表明中、高劑量組乳清蛋白肽可以提高衰老小鼠的被動回避反應(yīng)能力，高劑量組效果最好，低劑量組的效果不明顯。

2.2 避暗實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果

圖1 乳清蛋白肽對電擊時(shí)間和電擊次數(shù)的影響

圖1為乳清蛋白肽對電擊時(shí)間和電擊次數(shù)的影響。由圖1可以看出，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組小鼠的電擊時(shí)間和電擊次數(shù)均顯著減少，說明小鼠的躲避能力有所增強(qiáng)；采用Duncan法對各組的指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與老年模型組相比，青年對照組、腦復(fù)康對照組和乳清蛋白肽中、高劑量組的電擊時(shí)間和電擊次數(shù)均顯著減少，乳清蛋白肽低劑量組的電擊時(shí)間也顯著減少，但電擊次數(shù)無顯著變化；與此同時(shí)，與青年對照組和腦復(fù)康對照組相比，乳清蛋白肽劑量組的電擊時(shí)間和電擊次數(shù)均顯著增加。說明一定劑量的乳清蛋白肽雖可以提高衰老小鼠的避暗能力，但與青年和腦復(fù)康對照組相比還有一定差距。

2.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果

2.3.1 定位航行實(shí)驗(yàn)

圖2為乳清蛋白肽對水迷宮逃避潛伏期、游泳路程、游泳速度和朝向角的影響。

由圖2可以看出，時(shí)間與組間無交互作用；隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組動物的逃避潛伏期、游泳路程和朝向角均顯著減少，游泳速度顯著增加，說明經(jīng)過6天訓(xùn)練，小鼠的學(xué)習(xí)能力均有不同程度的增強(qiáng)。采用Duncan法對各組的指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，與老年模型組相比，青年對照組、腦復(fù)康對照組和乳清蛋白肽劑量組的逃避潛伏期、游泳路程、游泳速度和朝向角顯著減少；但分別與青年對照組和腦復(fù)康對照組相比，乳清蛋白肽劑量組的逃避潛伏期、游泳路程仍有顯著增加，游泳速度和朝向角雖然個(gè)別數(shù)值有些波動，但整體趨勢有所增加，且各組之間均存在顯著性差異。說明乳清蛋白肽在一定程度上能夠改善衰老小鼠的學(xué)習(xí)能力。

2.3.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)第7天，撤去平臺后進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，與老年模型組相比，青年對照組、腦復(fù)康對照組和乳清蛋白肽劑量組在目標(biāo)象限停留時(shí)間、時(shí)間百分比、路程百分比、經(jīng)過平臺次數(shù)均顯著增加；初次穿越平臺的時(shí)間顯著減少；乳清蛋白肽低、中劑量組在目標(biāo)象限停留路程增加；青年對照組、腦復(fù)康對照組和乳清蛋白肽高劑量組在目標(biāo)象限停留路程減少；分別與青年對照組以及腦復(fù)康對照組相比，乳清蛋白肽劑量組在目標(biāo)象限停留時(shí)間、時(shí)間百分比、路程百分比、經(jīng)過平臺次數(shù)顯著減少；目標(biāo)象限停留路程、初次穿越平臺的時(shí)間顯著增加；且各組之間均存在顯著性差異，與乳清蛋白肽呈良好的量效關(guān)系，說明乳清蛋白肽能夠改善衰老小鼠的空間記憶能力。

2.3.3 水迷宮游泳軌跡類型

搜索策略是衡量動物分析判斷能力和解決問題能力的指標(biāo)。水迷宮游泳軌跡如圖3所示，圖3中，小鼠的搜索策略隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加而呈現(xiàn)“邊緣式→隨機(jī)式→趨向式→直線式”的變化規(guī)律，學(xué)習(xí)記憶能力好的小鼠，經(jīng)過3～5 d的訓(xùn)練，其搜索策略以趨向式和直線式為主（統(tǒng)稱為空間策略），而較差的則以邊緣式和隨機(jī)式為主。

表3 乳清蛋白肽對第7天空間探索實(shí)驗(yàn)的影響 （n=10）

圖2 對水迷宮逃避潛伏期、游泳路程、游泳速度和朝向角的影響

在定位航行與空間探索實(shí)驗(yàn)中，每組10只小鼠，共游泳280次，搜索策略結(jié)果顯示（表4），老年模型組游泳軌跡以隨機(jī)型和邊緣型為主，共188次，說明需要較長時(shí)間和游泳路程才能找到平臺；與老年模型組相比，青年對照組、腦復(fù)康對照組和乳清蛋白肽劑量組的趨向型和直線型軌跡總數(shù)有所增加；分別與青年對照組相比以及與腦復(fù)康對照組相比，乳清蛋白肽低、中劑量組的趨向型和直線型軌跡總數(shù)有所減少，乳清蛋白肽高劑量組的趨向型和直線型軌跡總數(shù)有所增加，說明衰老小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶保持能力得到明顯改善。這可能是由于乳清蛋白肽具有抗氧化活性，可以清除腦內(nèi)自由基，阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生，降低過氧化物的生成，從而延緩大腦的衰老，對學(xué)習(xí)記憶力具有一定改善作用。

圖3 水迷宮游泳軌跡

表4 乳清蛋白肽對水迷宮游泳軌跡的影響

3 結(jié)論

在跳臺和穿梭箱實(shí)驗(yàn)中，乳清蛋白肽灌胃后可以增加衰老小鼠跳臺潛伏期和減少跳臺錯(cuò)誤次數(shù)，減小電擊時(shí)間和電擊次數(shù)，其中中、高劑量組效果顯著；在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，從整體趨勢上看，乳清蛋白肽灌胃后可以減少定位航行實(shí)驗(yàn)中衰老小鼠的逃避潛伏期、游泳路程、游泳速度和朝向角，增加空間探索實(shí)驗(yàn)中的目標(biāo)象限停留時(shí)間、目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比、目標(biāo)象限停留路程百分比、經(jīng)過平臺次數(shù)和減少初次穿越平臺的時(shí)間，同時(shí)游泳軌跡也向趨向型和直線型發(fā)展，可見乳清蛋白肽能夠提高衰老小鼠的被動回避和空間學(xué)習(xí)記憶能力。

但是本研究制備的乳清蛋白抗氧化肽對行為學(xué)的影響目前仍不如腦復(fù)康等西藥，與青年小鼠相比也尚存在一定差距，也許可以通過改進(jìn)制備方式純化方法等，獲得具有功能性質(zhì)效果更好的乳清蛋白肽，因此，在乳清蛋白肽功能特性的開發(fā)和利用，以及其對行為學(xué)的影響上，還需要進(jìn)一步的研究。

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