UPLC-MS/MS法測(cè)定牛乳中己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮?dú)埩?/h1>
2015-12-16 07:44:00崔向云張雪峰李照袁鳳琴徐向峰常建軍宋曉東
中國(guó)乳品工業(yè) 2015年10期
崔向云，張雪峰，李照，袁鳳琴，徐向峰，常建軍，宋曉東
（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司中心實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特011500）
0 引言
己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮都屬于己烯雌酚類激素，是人工合成的非類固醇同化性激素，曾被用在畜牧業(yè)養(yǎng)殖過程中，用來提高飼料轉(zhuǎn)化率及促進(jìn)牲畜生長(zhǎng)[1,3]。為了防止這些激素隨畜產(chǎn)品進(jìn)入人體，危害人類健康，建立一種該類化合物的快速檢驗(yàn)方法成為解決這一問題的關(guān)鍵。
目前，檢測(cè)該類激素的方法有分光光度法、酶聯(lián)免疫法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[1,2,4]。近年來，由于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有高靈敏度、高選擇性，在食品中獸藥殘留的檢測(cè)應(yīng)用越來越多[2,5,6]。然而，絕大多數(shù)方法樣品前處理方法耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于企業(yè)日常快速檢測(cè)。本文提供了一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)液態(tài)乳中己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的方法。
1 實(shí)驗(yàn)
1.1 儀器、試劑與材料
超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI），固相萃取裝置。
己烯雌酚、玉米赤霉醇、玉米赤霉酮標(biāo)準(zhǔn)品；甲醇、乙腈均為色譜純；實(shí)驗(yàn)室用水為去離子水；MAX固相萃取柱（60 mg/3 mL）。
1.2 溶液的配制
標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取適量的己烯雌酚、玉米赤霉醇、玉米赤霉酮標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃冰箱儲(chǔ)存。使用時(shí)，根據(jù)需要再用甲醇稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。固相萃取淋洗液：取5 mL甲醇，用超純水定容至100 mL；固相萃取洗脫洗液：取5 mL甲酸，用甲醇定容至100 mL；定容液的配制：取50 mL乙腈和50 mL超純水混合。
1.3 色譜條件
色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1mm×100mm，1.8 μm）；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣體積為5 μL；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水；梯度洗脫為0～3.0 min，體積分?jǐn)?shù)為50%～80%的A溶液；3.0～4.0 min，體積分?jǐn)?shù)為80%～100%的A溶液；4.0～4.5 min，體積分?jǐn)?shù)為100%～50%的A溶液；4.5～5.0 min，體積分?jǐn)?shù)為50%A溶液；流速為0.35 mL/min。
1.4 質(zhì)譜條件
離子化模式為電噴霧負(fù)離子模式（ES-）；質(zhì)譜掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電離電壓為3.00 kV；離子源溫度為110℃；去溶劑氣溫度為350℃；去溶劑氣（N2）流量為500 L/h；碰撞氣（高純Ar）流量為50 L/h。錐孔電壓、碰撞能量及定性和定量離子等質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。
表1 己烯雌酚、玉米赤霉醇、玉米赤霉酮的質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間
1.5 樣品前處理
1.5.1 樣品的提取
稱取液奶樣品2 g，精確到0.1 mg，于10 mL離心管中，加入3 mL乙腈，渦旋混合30 s，于離心機(jī)上以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心5 min，取上清液至50 mL離心管中，再在沉淀中加入2 mL乙腈，渦旋混合30 s，于離心機(jī)上以5 000 r/min離心5 min，合并上清液；在上清液中加入5 mL超純水，混合均勻并用濃度為1.0 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至11.0，待凈化。
1.5.2 樣品的凈化
MAX固相萃取小柱預(yù)先用5 mL甲醇、5 mL水活化及平衡，將提取液經(jīng)過小柱，待提取液自然流凈后，用5 mL淋洗液淋洗固相萃取柱，減壓抽干固相萃取柱15 s后，用5 mL洗脫液洗脫，并收集洗脫液，氮吹儀吹干后用1 mL定容液溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定。
2 結(jié)果
2.1 回收率和精密度
圖1是純牛奶中加標(biāo)己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮得到的MRM色譜圖。實(shí)驗(yàn)以未檢出己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的乳制品作為空白樣品，分別對(duì)空白樣品加標(biāo)做了回收率實(shí)驗(yàn)。純牛奶中添加己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的質(zhì)量濃度為2.0，5.0和10.0 μg/L。每個(gè)水平做6次平行實(shí)驗(yàn)，取其平均值作為最終回收率。純牛奶中添加己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的最終回收率分別為72.3%～94.5%、72.8%～87.4%和88.9%～110.6%，而且各平行樣間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，平行性很好（見表2）。
圖1 純牛奶中添加己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的MRM色譜
表2 牛奶中添加己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的回收率及精密度
2.2 線性關(guān)系、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）
將己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮標(biāo)準(zhǔn)工作液用空白基質(zhì)溶液分別配制質(zhì)量濃度為1，5，10，20，50 μg/L和100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)行測(cè)定。以待測(cè)物定量離子的峰面積Y對(duì)其質(zhì)量濃度X（μg/L）得到己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的線性回歸方程如表3所示。
表3 己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的線性回歸方程
根據(jù)3倍信噪比得到牛奶中己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的檢出限均為0.5 μg/kg；根據(jù)10倍信噪比，并計(jì)入試樣量及最終的定容體積，得出其定量限均為1.0 μg/kg。
3 結(jié)論
采用本方法，樣品最終回收率與國(guó)標(biāo)方法相當(dāng)，而且各平行樣間的平行性較好。與國(guó)標(biāo)方法相比較，本方法的樣品前處理過程相對(duì)簡(jiǎn)單，能大大節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，可用于牛乳中己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮?dú)埩舻目焖贆z測(cè)。
[1]吳延暉，許泓，何佳，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中非類固醇激素殘留量[J].食品研究與開發(fā)，2010，31（9）：140-144.
[2]張艷，陳劍剛，馮翠霞.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛奶中7種雌激素類藥物殘留[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，20（6）：740-743.
[3]劉宏程，鄒艷紅，黎其萬，等.高效液相色譜分離牛奶中己烯雌酚、己烷雌酚和雙烯雌酚[J].分析化學(xué)，2008，36（2）：245-248.
[4]周建科，岳強(qiáng)，宿書芳，等.牛奶中雌性激素的高效液相色譜分析[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2005，33（11）：56-58.
[5]周建科，唐翠苓，韓朝家，等.固相分散萃取-液相色譜法測(cè)定奶酪中3種雌激素[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2012，40（1）：56-58.
[6]劉艷琴，王浩，楊紅梅，等.液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定嬰兒乳粉中雙酚A和己烯雌酚[J].食品研究與開發(fā)，2013，34（17）：80-83.
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目前，檢測(cè)該類激素的方法有分光光度法、酶聯(lián)免疫法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[1,2,4]。近年來，由于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有高靈敏度、高選擇性，在食品中獸藥殘留的檢測(cè)應(yīng)用越來越多[2,5,6]。然而，絕大多數(shù)方法樣品前處理方法耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于企業(yè)日常快速檢測(cè)。本文提供了一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)液態(tài)乳中己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的方法。
1 實(shí)驗(yàn)
1.1 儀器、試劑與材料
超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI），固相萃取裝置。
己烯雌酚、玉米赤霉醇、玉米赤霉酮標(biāo)準(zhǔn)品；甲醇、乙腈均為色譜純；實(shí)驗(yàn)室用水為去離子水；MAX固相萃取柱（60 mg/3 mL）。
1.2 溶液的配制
標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取適量的己烯雌酚、玉米赤霉醇、玉米赤霉酮標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃冰箱儲(chǔ)存。使用時(shí)，根據(jù)需要再用甲醇稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。固相萃取淋洗液：取5 mL甲醇，用超純水定容至100 mL；固相萃取洗脫洗液：取5 mL甲酸，用甲醇定容至100 mL；定容液的配制：取50 mL乙腈和50 mL超純水混合。
1.3 色譜條件
色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1mm×100mm，1.8 μm）；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣體積為5 μL；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水；梯度洗脫為0～3.0 min，體積分?jǐn)?shù)為50%～80%的A溶液；3.0～4.0 min，體積分?jǐn)?shù)為80%～100%的A溶液；4.0～4.5 min，體積分?jǐn)?shù)為100%～50%的A溶液；4.5～5.0 min，體積分?jǐn)?shù)為50%A溶液；流速為0.35 mL/min。
1.4 質(zhì)譜條件
離子化模式為電噴霧負(fù)離子模式（ES-）；質(zhì)譜掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電離電壓為3.00 kV；離子源溫度為110℃；去溶劑氣溫度為350℃；去溶劑氣（N2）流量為500 L/h；碰撞氣（高純Ar）流量為50 L/h。錐孔電壓、碰撞能量及定性和定量離子等質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。
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1.5.1 樣品的提取
稱取液奶樣品2 g，精確到0.1 mg，于10 mL離心管中，加入3 mL乙腈，渦旋混合30 s，于離心機(jī)上以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心5 min，取上清液至50 mL離心管中，再在沉淀中加入2 mL乙腈，渦旋混合30 s，于離心機(jī)上以5 000 r/min離心5 min，合并上清液；在上清液中加入5 mL超純水，混合均勻并用濃度為1.0 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至11.0，待凈化。
1.5.2 樣品的凈化
MAX固相萃取小柱預(yù)先用5 mL甲醇、5 mL水活化及平衡，將提取液經(jīng)過小柱，待提取液自然流凈后，用5 mL淋洗液淋洗固相萃取柱，減壓抽干固相萃取柱15 s后，用5 mL洗脫液洗脫，并收集洗脫液，氮吹儀吹干后用1 mL定容液溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定。
2 結(jié)果
2.1 回收率和精密度
圖1是純牛奶中加標(biāo)己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮得到的MRM色譜圖。實(shí)驗(yàn)以未檢出己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的乳制品作為空白樣品，分別對(duì)空白樣品加標(biāo)做了回收率實(shí)驗(yàn)。純牛奶中添加己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的質(zhì)量濃度為2.0，5.0和10.0 μg/L。每個(gè)水平做6次平行實(shí)驗(yàn)，取其平均值作為最終回收率。純牛奶中添加己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的最終回收率分別為72.3%～94.5%、72.8%～87.4%和88.9%～110.6%，而且各平行樣間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，平行性很好（見表2）。
圖1 純牛奶中添加己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的MRM色譜
表2 牛奶中添加己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的回收率及精密度
2.2 線性關(guān)系、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）
將己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮標(biāo)準(zhǔn)工作液用空白基質(zhì)溶液分別配制質(zhì)量濃度為1，5，10，20，50 μg/L和100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)行測(cè)定。以待測(cè)物定量離子的峰面積Y對(duì)其質(zhì)量濃度X（μg/L）得到己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的線性回歸方程如表3所示。
表3 己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的線性回歸方程
根據(jù)3倍信噪比得到牛奶中己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的檢出限均為0.5 μg/kg；根據(jù)10倍信噪比，并計(jì)入試樣量及最終的定容體積，得出其定量限均為1.0 μg/kg。
3 結(jié)論
采用本方法，樣品最終回收率與國(guó)標(biāo)方法相當(dāng)，而且各平行樣間的平行性較好。與國(guó)標(biāo)方法相比較，本方法的樣品前處理過程相對(duì)簡(jiǎn)單，能大大節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，可用于牛乳中己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮?dú)埩舻目焖贆z測(cè)。
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[2]張艷，陳劍剛，馮翠霞.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛奶中7種雌激素類藥物殘留[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，20（6）：740-743.
[3]劉宏程，鄒艷紅，黎其萬，等.高效液相色譜分離牛奶中己烯雌酚、己烷雌酚和雙烯雌酚[J].分析化學(xué)，2008，36（2）：245-248.
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[5]周建科，唐翠苓，韓朝家，等.固相分散萃取-液相色譜法測(cè)定奶酪中3種雌激素[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2012，40（1）：56-58.
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