田秀慧，薛敬林，孫 巖，任傳博，徐英江，劉慧慧，黃 會(huì)，宮向紅,*

（1.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264006；2.煙臺(tái)山水海產(chǎn)有限公司，山東 煙臺(tái) 264006）

己烯雌酚及其代謝物在泥鰍體內(nèi)的組織分布及藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究

田秀慧1，薛敬林2，孫 巖1，任傳博2，徐英江1，劉慧慧1，黃 會(huì)2，宮向紅1,*

（1.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264006；2.煙臺(tái)山水海產(chǎn)有限公司，山東 煙臺(tái) 264006）

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，研究口服灌藥給藥方式下，己烯雌酚及其主要代謝物雙烯雌酚在泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）體內(nèi)的組織分布和藥物代謝動(dòng)力學(xué)。在（12±2）℃水溫條件下，泥鰍口服灌藥（以體質(zhì)量計(jì)，下同）0.1、1.0、10.0 mg/kg后，其血漿、肌肉和肝臟中己烯雌酚含量-時(shí)間曲線關(guān)系符合一級(jí)吸收的二室開放動(dòng)力學(xué)模型。以1.0 mg/kg為例，3 種組織中己烯雌酚峰值水平肝臟最高、肌肉次之、血漿最低，平均消除速率分別為22.46、3.32、5.05 μg/（kg·h），6、72、120 h后均降至檢出限以下。雙 烯雌酚在血漿、肌肉和肝臟中變化趨勢(shì)與己烯雌酚基本相似，在血漿、肌肉和 肝臟中1、4、4 h達(dá)到最大濃度值，6、72、96 h降到檢出限以下。采用DAS 2.0 藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算程序，計(jì)算有關(guān) 藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明：己烯雌酚在泥鰍體內(nèi)消除較快，血漿、肌肉、肝臟的含量-時(shí)間曲線下面積相差較大，說明不同組織對(duì)己烯雌酚的蓄積能力有 所差別；己烯雌酚在泥鰍體內(nèi)各組織分布廣，消除快。在本實(shí)驗(yàn)條件下，己烯雌酚在0.1、1.0、10.0 mg/kg口服灌藥劑量下，建議其消除期分別定為3、5、5 d；并且水溫高時(shí)可適當(dāng)縮短消除期，水溫低時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)消除期。

己烯雌酚；雙烯雌酚；泥鰍；藥物代謝動(dòng)力學(xué)；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）和雙烯雌酚（dienestrol，DS）是人工合成的非甾體雌激素物質(zhì)，雙烯雌酚已經(jīng)被證實(shí)為己烯雌酚的代謝物[1-3]，兩物質(zhì)均具有化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易通過化學(xué)合成獲得和成本低的特點(diǎn)[4-5]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，其主要作用是添加到魚類飼料中[6-9]，刺激魚類正常代謝，促進(jìn)魚類體內(nèi)氮停留增加，加快魚體內(nèi)氨基酸合成蛋白質(zhì)的速度，最終起到促進(jìn)魚類生長(zhǎng)的作用[10-11]。但水產(chǎn)品中殘留的己烯雌酚和雙烯雌酚通過食物鏈進(jìn)入人體后，會(huì)破壞人體的正常生理平衡，其對(duì)人類的危害被逐漸發(fā)現(xiàn)，且已被證實(shí)是一種致癌物質(zhì)，嚴(yán)重危害人和動(dòng)物的健康[12-15]。美國(guó)和歐盟已禁止使用己烯雌酚。2002年，農(nóng)業(yè)部第193號(hào)公告禁止己烯雌酚在所有食用動(dòng)物中使用[16-17]；并在第235號(hào)公告中規(guī)定己烯雌酚在動(dòng)物性食品中不得檢出[18]。

目前國(guó)外對(duì)己烯雌酚代謝研究主要集中在哺乳動(dòng)物[19-20]，國(guó)內(nèi)主要關(guān)注其毒性[21-22]。泥鰍作為我國(guó)重要的食用魚類，不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高。本實(shí)驗(yàn)采用口服灌藥法對(duì)常規(guī)養(yǎng)殖的泥鰍給藥，在已建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定己烯雌酚和雙烯雌酚的基礎(chǔ)上，分析己烯雌酚和代謝物雙烯雌酚在泥鰍血漿、肌肉和肝臟中的組織分布和藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以期全面了解其在泥鰍體內(nèi)的殘留、消除和藥物動(dòng)力學(xué)特征。本實(shí)驗(yàn)可為其他水生生物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)提供參考，并為水產(chǎn)養(yǎng)殖提供科學(xué)用藥依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

己烯雌酚（CAS：56-53-1）標(biāo)準(zhǔn)品、雙烯雌酚（CAS：84-17-3）標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.5%）、內(nèi)標(biāo)D8-己烯雌酚（91318-10-4，純度99.5%） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；低分子質(zhì)量肝素鈉注射液（5 000 IU） 杭州九源基因工程有限公司；甲醇、乙酸乙酯、正己烷、乙腈（均為色譜純），鹽酸為優(yōu)級(jí)純，碳酸鈉為分析純，所用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ Vantage超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Scientific公司；Milli-Q Gradient超純水儀、0.22 μm微孔濾膜 法國(guó)Millipore公司；TGL-10C高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ-600E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Laborota 4001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司；N-EVAPTM112氮吹儀 美國(guó)Organomation Associates公司；HLB固相萃取小柱（60 mg，3 mL） 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及采樣程序

實(shí)驗(yàn)用泥鰍，體質(zhì)量25～35 g，實(shí)驗(yàn)前抽樣檢查無己烯雌酚及代謝物雙烯雌酚，實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)3 d，每天換水1 次，期間不喂食 。挑選大小均勻、體質(zhì)量正常個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)容器為長(zhǎng)方形玻璃水槽（70 cm×40 cm×50 cm），連續(xù)充氧保持水中溶解氧大于5.0 mg/L，暫養(yǎng)期間泥鰍存活率大于95%。選擇經(jīng)過暫養(yǎng)的健康泥鰍，隨機(jī)分為10 個(gè)組，每組約80 尾。

準(zhǔn)確稱量一定量己烯雌酚，用冷卻的淀粉乳濁液溶解定容，并滴入少量食用色素溶液（配制方法：稱取0.1 g苯酚紅溶于100 mL水），使淀粉乳濁液呈紅色。每尾魚根據(jù)體質(zhì)量口服相應(yīng)體積己烯雌酚，按照0.1、1.0、10.0 mg/kg 3 個(gè)量口服灌藥，實(shí)驗(yàn)過程中，記錄時(shí)間，并且做好標(biāo)簽。具體操作方法：1 mL注射器上接長(zhǎng)約為5 cm左右的軟管，吸取適量己烯雌酚后，通到魚的胃部，灌藥后無紅色液體吐出，即可作為實(shí)驗(yàn)用，否則棄之。每個(gè)添加量組在相同的實(shí)驗(yàn)條件下設(shè)置3 個(gè)重復(fù)組。分別在口服灌藥后的0.1、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、16、20、24、48、72、96、120、144、168、192、216 h采樣，每天記錄水溫和泥鰍的死亡情況。

對(duì)于控制室設(shè)置有流量計(jì)算機(jī)的計(jì)量系統(tǒng)應(yīng)根據(jù)渦輪流量計(jì)的檢定結(jié)果，及時(shí)修改計(jì)算機(jī)中設(shè)置的儀表系數(shù)，確保工況流量傳輸?shù)臏?zhǔn)確。要根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)工藝情況以及儀表性能，正確選擇小流量切除的工況點(diǎn)，對(duì)于具有壓力、溫度傳輸故障自動(dòng)補(bǔ)償功能的流量計(jì)算機(jī)要根據(jù)工況設(shè)置壓力、溫度的預(yù)設(shè)值，同時(shí)要合理選取壓力、溫度、流量的上下限報(bào)警點(diǎn)，以確保流量計(jì)算機(jī)的正常運(yùn)行。

血液樣品采集：泥鰍用抄網(wǎng)撈起，用干凈紗布擦干魚體，插入鰓下心臟取血，放入離心管中（離心管事先放人少量肝素鈉），混合均勻后離心，取上層血漿，置于-18 ℃保存。肌肉和肝臟樣品采集：去除泥鰍內(nèi)臟、皮和骨骼等，取肌肉攪碎，裝入密封袋；將整個(gè)肝臟取出，裝入離心管。肌肉和肝臟均置于-18 ℃保存，測(cè)定前將其在室溫條件下解凍。

1.3.2 樣品前處理及凈化

血液樣品：取適量血液樣品于離心管中，加3 mL 10 g/100 mL碳酸鈉溶液，20 mL乙酸乙酯，均質(zhì)30 s，超聲波提取10 min，離心取上清液于梨形瓶中，殘?jiān)偌尤?0 mL乙酸乙酯，重復(fù)提取1 次，合并上清液，于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用1 mL甲醇溶解殘留物，加9 mL水稀釋備用。肌肉和肝臟樣品：稱取適量樣品于離心管中，加3 mL 10 g/100 mL碳酸鈉溶液，20 mL乙酸乙酯，均質(zhì)30 s，超聲波提取10 min，離心取上清液于梨形瓶中，殘?jiān)偌尤?0 mL乙酸乙酯，重復(fù)提取1 次，合并上清液，于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用1 mL甲醇溶解殘留物，加9 mL水稀釋備用。

依次用10 mL乙酸乙酯、10 mL甲醇和10 mL pH 3.0的鹽酸溶液活化HLB固相萃取小柱，取備用液過柱，控制流速不超過2 mL/min，用10 mL水-甲醇（9∶1，V/V）淋洗小柱，將固相萃取柱抽干，用10 mL正己烷淋洗小柱，將固相萃取柱抽干，最后用5 mL乙酸乙酯洗脫，控制流速不超過2 mL/min。收集洗脫液，40 ℃水浴中氮吹至近干后用流動(dòng)相再次溶解，過0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.3.3 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法

1.3.3.1 液相色譜條件

色譜柱：Thermo C18柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相：甲醇和水；流速：0.25 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table1 Program of gradient elution

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

表2 己烯雌酚和雙烯雌酚母離子、子離子和碰撞能量Table2 Parent ions, product ions and collision energy of diethylstilbestrol and dienestrol

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定值取重復(fù)組的平均值，采用DAS 2.0藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算程序，在計(jì)算機(jī)上處理口服灌藥后泥鰍體內(nèi)的己烯雌酚含量-時(shí)間數(shù)據(jù)，計(jì)算出有關(guān)藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚的定量分析及回收率

配制質(zhì)量濃度分別為5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，流動(dòng)相定容，測(cè)定結(jié)果采用內(nèi)標(biāo)法定量，己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.632 8×10-2x-0.110 2×10-1，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 8；雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.125 5×10-1x-0.445 9×10-2，相關(guān)系數(shù)R2= 0.990 2。上述兩方程中，x代表己烯雌酚或雙烯雌酚的質(zhì)量濃度，y代表己烯雌酚或雙烯雌酚與內(nèi)標(biāo)物D8-己烯雌酚的峰面積比值。需要注意的是，因己烯雌酚具有順反結(jié)構(gòu)，且其比例會(huì)因前處理?xiàng)l件和標(biāo)準(zhǔn)品放置時(shí)間而發(fā)生變化，且在本實(shí)驗(yàn)條件下，無法測(cè)定其比例，所以己烯雌酚與內(nèi)標(biāo)物D8-己烯雌酚的峰面積均取順反異構(gòu)體的峰面積之和。在空白泥鰍樣品中添加己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為0.5 μg/kg時(shí)，信噪比大于10，表明己烯雌酚檢測(cè)下限可以達(dá)到0.5 μg/kg；在空白樣品中添加雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為1.0 μg/kg時(shí)，信噪比大于10，表明雙烯雌酚定量下限可以達(dá)到1.0 μg/kg。

以空白泥鰍樣品為基質(zhì)，己烯雌酚在0.5、5.0、25.0 μg/kg 3 個(gè)水平，雙烯雌酚在1.0、10.0、50.0 μg/kg 3 個(gè)水平分別進(jìn)行方法回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平組平行測(cè)定6 次，結(jié)果表明：己烯雌酚在上述3 個(gè)水平的平均回收率在74.6%～106%之間，組內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）在5.13%～7.89%之間；雙烯雌酚在上述3 個(gè)水平的平均回收率在74.1%～90.2%之間，組內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）在5.62%～8.50%之間；本方法結(jié)果穩(wěn)定可靠，可以用于泥鰍實(shí)際樣品的分析測(cè)定。

2.2 口服灌藥后己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚在泥鰍血漿中的分布和消除

圖1 口服灌藥后己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚在泥鰍血漿中的含量-時(shí)間關(guān)系Fig.1 Contents of diethylstilbestrol and its metabolite dienestrol in plasma versus time

泥鰍口服灌藥0.1、1.0、10.0 mg/kg己烯雌酚后，血漿中己烯雌酚及代謝物雙烯雌酚含量-時(shí)間曲線如圖1所示。自口服灌藥后，泥鰍體內(nèi)己烯雌酚含量逐漸增大，上述3 個(gè)劑量組均在第1小時(shí)達(dá)到最大值，最大值分別為9.57、112.3、1 097 μg/L，相當(dāng)于灌藥劑量的0.095 7、0.112、0.110倍；隨后泥鰍血漿內(nèi)己烯雌酚含量逐漸減少，上述3 個(gè)劑量組均在6 h降至檢出限以下，均出現(xiàn)前期消除速率快、后期消除速率相對(duì)減緩的趨勢(shì)，己烯雌酚平均消除速率分別1.914、22.46、219.4 μg/（L·h）。代謝物雙烯雌酚呈現(xiàn)與己烯雌酚相似的變化趨勢(shì)，在給藥后0.1 h檢測(cè)出雙烯雌酚，給藥后1 h達(dá)到最大含量，分別為4.57、49.2、408 μg/L，均在6 h降至檢出限以下，消除速率趨勢(shì)與己烯雌酚一致，其平均消除速率分別0.914、9.84、81.6 μg/（L·h）；含量越高，平均消除速率越大；雙烯雌酚平均消除速率均小于相同條件下己烯雌酚的平均消除速率。

2.3 口服灌藥后己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚在泥鰍肌肉中的分布和消除

圖2 口服灌藥后己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚在泥鰍肌肉中的含量-時(shí)間關(guān)系Fig.2 Contents of diethylstilbestrol and its metabolite dienestrol in muscle versus time

泥鰍口服灌藥0.1、1.0、10.0 mg/kg己烯雌酚后，肌肉中己烯雌酚及代謝物雙烯雌酚含量-時(shí)間曲線如圖2所示。自一次口服灌藥后，肌肉中己烯雌酚含量逐漸增大，上述3 個(gè)劑量組均在第4小時(shí)達(dá)到最大水平，分別為20.9、225.8、2 368 μg/kg，相當(dāng)于灌藥劑量的0.209、0.226、0.237 倍；隨后泥鰍體內(nèi)己烯雌酚含量逐漸減少，上述3 個(gè)劑量組分別在24、72、96 h降至檢出限以下，均出現(xiàn)前期消除速率快、后期消除速率相對(duì)減緩的趨勢(shì)；至實(shí)驗(yàn)第24小時(shí)，己烯雌酚已降至0、3.06、34.7 μg/kg，僅為最高水平的0%、1.36%和1.47%，己烯雌酚平均消除速率分別1.045、3.32、25.74 μg/（kg·h）。說明高劑量組己烯雌酚平均消除速率明顯大于低劑量組；若劑量減少百分比相同的條件下，高劑量組所需時(shí)間更短。代謝物雙烯雌酚呈現(xiàn)與己烯雌酚相似的變化趨勢(shì)，分別在給藥后0.5、0.1、0.1 h檢測(cè)出雙烯雌酚，給藥后4 h達(dá)到最大含量，分別為9.03、87.3、899 μg/kg，并在24、72、96 h降至檢出限以下，消除速率趨勢(shì)與己烯雌酚一致，雙烯雌酚平均消除速率分別0.45、1.28、9.77 μg/（kg·h）。

類似血漿，己烯雌酚及代謝物雙烯雌酚在泥鰍肌肉中均出現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)。隨著口服灌藥劑量升高，己烯雌酚和雙烯雌酚含量也逐漸上升。對(duì)于不同口服灌藥劑量下的泥鰍，肌肉的消除情況與血漿中趨勢(shì)相似，且相比血漿中含量，相同消除時(shí)間后，肌肉中含量高于血漿中含量。在相同灌藥劑量下，己烯雌酚和雙烯雌酚在肌肉中的平均消除速率均小于血漿，可能是由于代謝物易于結(jié)合泥鰍肌肉中的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致消除速率減慢。

2.4 口服灌藥后己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚在泥鰍肝臟中的分布和消除

泥鰍口服灌藥0.1、1.0、10.0 mg/kg己烯雌酚后，肝臟中己烯雌酚及代謝物雙烯雌酚含量-時(shí)間曲線如圖3所示，相比較己烯雌酚在血漿及肌肉中的分布和消除，肝臟表現(xiàn)出明顯的富集能力。自口服灌藥后，肝臟中己烯雌酚含量逐漸增大，上述3 個(gè)劑量組均在第4小時(shí)達(dá)到最大值，最大值分別為50.5、585.6、6 785 μg/kg，相當(dāng)于灌藥的0.505、0.586、0.678 倍；隨后泥鰍體內(nèi)己烯雌酚含量逐漸減少，上述3 個(gè)劑量組分別在72、120、120 h降至檢出限以下，均出現(xiàn)前期消除速率快、后期消除速率相對(duì)減緩的趨勢(shì)；至實(shí)驗(yàn)第24小時(shí)，己烯雌酚已降至7.52、45.2、250 μg/kg，僅為最高濃度的14.9%、7.72%和3.68%，己烯雌酚平均消除速率分別為0.74、5.05、58.5 μg/（kg·h）。說明在肝臟中，高劑量組己烯雌酚消除速率明顯大于低劑量組；若劑量減少百分比相同的條件下，高劑量組所需時(shí)間更短。代謝物雙烯雌酚呈現(xiàn)與己烯雌酚相似的變化趨勢(shì)，在給藥后0.25、0.1、0.1 h檢測(cè)出雙烯雌酚，給藥后4 h達(dá)到最大含量，分別為30.8、298.2、2 435 μg/kg，并在72、96、96 h降至檢出限以下，消除速率趨勢(shì)與己烯雌酚一致，其平均消除速率分別0.45、3.24、26.47 μg/（kg·h）。

隨著己烯雌酚口服灌藥劑量的升高，肝臟中己烯雌酚含量上升；這一點(diǎn)與血漿和肌肉中的變化趨勢(shì)相同，而且在相同口服灌藥劑量下，肝臟中含量是最大的。對(duì)于不同口服灌藥劑量下的泥鰍，經(jīng)相同消除時(shí)間后，肝臟中己烯雌酚含量最高。相比較在血漿和肌肉中的分布和消除，在泥鰍肝臟中主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：1）在相同口服灌藥劑量時(shí)，相同取樣時(shí)間下，肝臟內(nèi)含量要遠(yuǎn)高于血漿和肌肉中含量；2）在相同口服灌藥劑量時(shí)，肝臟的平均消除速率、含量最高值以相對(duì)于灌藥劑量的倍數(shù)均高于血漿和肌肉，說明其富集能力遠(yuǎn)大于血漿和肌肉；3）雖然肝臟中平均消除速率最大，但其降至檢出限以下所需時(shí)間最長(zhǎng)。

圖3 口服灌藥后己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚在泥鰍肝臟中的含量-時(shí)間關(guān)系Fig.3 Contents of diethylstilbestrol and its metabolite dienestrol in liver versus time

2.5 己烯雌酚在泥鰍血漿、肌肉和肝臟中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)

采用DAS2.0藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算程序，處理口服灌藥后泥鰍血漿、肌肉和肝臟中己烯雌酚含量-時(shí)間數(shù)據(jù)，計(jì)算有關(guān)泥鰍血漿、肌肉和肝臟的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)；取其中一組己烯雌酚含量-時(shí)間數(shù)據(jù)，用對(duì)數(shù)圖進(jìn)行初步判斷，可見lgC與t呈雙指數(shù)函數(shù)特征，因此選擇二室模型。結(jié)果如表3所示。

表3 己烯雌酚在泥鰍血漿、肌肉和肝臟中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table3 Pharmacokinetic parameters of diethylstilbestrol in plasma, muscle and liver off Misgurnus anguillicaudatus

t1/2β為己烯雌酚的消除相半衰期，指己烯雌酚消除到一半所用的時(shí)間，是描述泥鰍對(duì)己烯雌酚的消除快慢、決定消除程度的重要指標(biāo)。在血漿中，隨著口服灌藥劑量的增大，t1/2β值異常，可能與實(shí)驗(yàn)過程中取樣時(shí)間點(diǎn)數(shù)、軟件本身的設(shè) 置程序或本實(shí)驗(yàn)室的分析測(cè)定條件有關(guān)，此結(jié)論有待進(jìn)一步研究。在肌肉中出現(xiàn)隨灌藥劑量增大，t1/2β逐漸減小的趨勢(shì)，但相差不大。肝臟在1.0 mg/kg條件下，t1/2β值明顯小于其他兩個(gè)劑量組，此原因有待進(jìn)一步探討。

AUC為己烯雌酚含量-時(shí)間曲線下面積，指己烯雌酚進(jìn)入泥鰍體內(nèi)藥量的多少，是衡量己烯雌酚在泥鰍體內(nèi)各組織器官吸收量的重要參數(shù)。以口服灌藥劑量1.0 mg/kg己烯雌酚為例，血漿、肌肉和 肝臟中AUC由高到低依次為：肝臟（5 517.853 μg/（kg·h））＞肌肉（1 479.485 μg/（kg·h））＞血漿（288.565 μg/（L·h））；數(shù)據(jù)顯示血漿、肌肉和肝臟中AUC值相差很遠(yuǎn)，肝臟對(duì)己烯雌酚的吸收量約是肌肉吸收量的4 倍和血漿吸收量的20 倍，說明己烯雌酚的蓄積能力因組織的不同有較大差別。

CL/F為總體清除率，即單位時(shí)間內(nèi)泥鰍各組織能消除相當(dāng)于多少容積血中所含的己烯雌酚，CL/F與t1/2β都是衡量己烯雌酚在泥鰍各組織消除快慢的指標(biāo)。以口服灌藥1.0 mg/kg己烯雌酚為例，血漿、肌肉和肝臟的CL/F值依次為2.708、0.675、0.181 L/（h·kg），在0.1、10.0 mg/kg劑量組CL/F值變化規(guī)律與1.0 mg/kg劑量組一致。上述數(shù)值均較小，說明己烯雌酚在泥鰍體內(nèi)分布廣，消除較快。己烯雌酚低的清除率有利于其藥效在泥鰍體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間維持。

當(dāng)口服灌藥后，泥鰍血漿、肌肉和肝臟中己烯雌酚含量逐漸增大，當(dāng)達(dá)到Cmax后，其含量逐漸下降，在口服灌藥的3 個(gè)劑量條件下，血漿中己烯雌酚含量均在6 h下降至檢出限以下；肌肉中己烯雌酚含量分別在20、16、 12 h后下降了90%以上；肝臟中己烯雌酚含量分別在48、24、16 h后下降了90%以上；值得注意的是，上述數(shù)據(jù)表明口服灌藥后，己烯雌酚在一定時(shí)間內(nèi)可以消除絕大部分，所用時(shí)間短，說明所研究時(shí)間內(nèi)平均消除速率較快，但并不代表其最終在體內(nèi)完全消除所用時(shí)間越短。

雙烯雌酚作為代謝物，部分相關(guān)吸收參數(shù)無法使用軟件計(jì)算，因此本研究?jī)H借鑒使用了消除實(shí)驗(yàn)部分的參數(shù)CL/F，可表明雙烯雌酚在泥鰍體內(nèi)消除速率的快慢，以口服灌藥1.0 mg/kg己烯雌酚為例，血漿、肌肉和肝臟中CL/F值分別為5.851、0.917、0.16 L/（h·kg）。在0.1、1.0、10.0 mg/kg劑量組CL/F值變化規(guī)律一致。表明雙烯雌酚在泥鰍體內(nèi)分布廣且易于消除。

2.6 己烯雌酚休藥期的規(guī)定

己烯雌酚通過口服灌藥方式進(jìn)入泥鰍體內(nèi)，在血漿、肌肉和肝臟中的分布 和消除能力均不相同，并且隨口服灌藥劑量的增大，己烯雌酚的蓄積量逐漸增加。泥鰍肝臟為主要解毒器官。口服灌藥后己烯雌酚滲透到血液中再經(jīng)肝臟，大部分己烯雌酚被肝臟截留積蓄，因此在血漿、肌肉和肝臟3 個(gè)組織中，肝臟己烯雌酚Cmax最大，富集能力最強(qiáng)，而且表現(xiàn)出最快的平均消除速率。當(dāng)泥鰍肝臟不能對(duì)己烯雌酚進(jìn)行全部截留時(shí)，部分己烯雌酚通過血液循環(huán)而被泥鰍其他 肌肉組織蓄積。所以建議盡量不要食用泥鰍肝臟。從飲食安全角度來講，食用泥鰍肌肉部分比食用泥鰍整體更安全。

目前水產(chǎn)品殘留限量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)己烯雌酚殘留限量做出了要求，規(guī)定己烯雌酚在水產(chǎn)品中不得檢出。因己烯雌酚在泥鰍肝臟內(nèi)消除時(shí)間最長(zhǎng)，因此將肝臟定為代謝靶組織，泥鰍口服灌藥0.1、1.0、10.0 mg/kg己烯雌酚后，泥鰍肝臟內(nèi)己烯雌酚和雙烯雌酚分別在3、5、5 d后均降至檢出限以下，因此在本實(shí)驗(yàn)室條件下，其休藥期可定為3、5、5 d。但在實(shí)際養(yǎng)殖過程中，存在多次重復(fù)給藥或投喂含己烯雌酚飼料的情況，投喂直至停藥期滿，泥鰍起池為止。所以本實(shí)驗(yàn)室條件下得出的休藥期比實(shí)際情況要短，綜合考慮可將其休藥期適當(dāng)延長(zhǎng)。值得注意的是，影響己烯雌酚在泥鰍體內(nèi)代謝的影響因素很多，但水溫影響最大。在某特定溫度范圍內(nèi)，水溫升高，己烯雌酚代謝強(qiáng)度增強(qiáng)；水溫降低，代謝強(qiáng)度減弱。水溫升高1 ℃，藥物的代謝和消除速率一般提高10%左右，因此在生產(chǎn)過程中，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況和養(yǎng)殖習(xí)慣適當(dāng)縮短或延長(zhǎng)休藥期。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用泥鰍作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在口服灌藥給藥方式下，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析測(cè)定己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚在血漿、肌肉和肝臟中的分布和殘留情況。同時(shí)規(guī)定了在本實(shí)驗(yàn)室條件下己烯雌酚和雙烯雌酚的休藥期，但在生產(chǎn)過程中，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況和養(yǎng)殖習(xí)慣適當(dāng)縮短或延長(zhǎng)休藥期，以保障食用者身體健康。

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Tissue Distribution and Pharmacokinetics of Diethylstilbestrol and Its Metabolite Dienestrol in Misgurnus anguillicaudatus

TIAN Xiu-hui1, XUE Jing-lin2, SUN Yan1, REN Chuan-bo2, XU Ying-jiang1, LIU Hui-hui1, HUANG Hui2, GONG Xiang-hong1,*
(1. Shandong Provincial Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology, Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006, China; 2. Yantai Shanshui Seafood Co. Ltd., Yantai 264006, China)

Tissue distribution and pharmacokinetics of diethylstilbestrol and its metabolite dienestrol in plasma, muscle and liver of Misgurnus anguillicaudatus under laboratory conditions using single oral administration were studied by ultra-performance liquid chromatogram tandem mass spectrometry in this work. After a single oral administration with diethylstilbestrol at 0.1, 1.0 and 10.0 mg/kg, diethylstilbestrol concentrations in plasma, muscle and liver versus time were well described by a twodepartment open model with first-order absorption. For example, after single oral administration at 1.0 mg/kg, the concentration of diethylstilbestrol in liver was highest, followed successiv ely by that in muscle and plasma. The average elimination speed was 22.46, 3.32 and 5.05 ?g/(kg·h) in plasma, muscle and liver, respectively. Diethylstilbestrol was not detected at 6, 72 and 120 h after oral administration. The changes in dienestrol concentrations were similar those with diethylstilbestrol. Dienestrol concentration in plasma, muscle and liver reached a peak at 1, 4 and 4 h, respectively, after oral administration, and was not detected at 6, 72 and 96 h after administration, which was shorter than that of diethylstilbestrol. DAS 2.0 pharmacokinetic parameter calculation program was used to process the data and calculate the relevant pharmacokinetic parameters. The results indicated that the area under concentration-time curve (AUC) differe d greatly in plasma, muscle and liver and these tissues had different accumulation capabilities. Diethylstilbestrol was eliminated fast. Distribution was dispersed and elimination was fast. Under the experimental conditions, the recommended withdrawal periods were 3, 5 and 5 d respectively. When the water temperature was higher than the experimental conditions, th e withdrawal period could be shortened and extended at lower water temperature. The concentrations versus time curves of diethylstilbestrol in Misgurnus anguillicaudatus provided useful information for studying decontamination of Misgurnus anguillicaudatus that had diethylstilbestrol contamination.

diethylstilbestrol; dienestrol; Misgurnus anguillicaudatus; pharmacokinetics; ultra performance liquid chro matogram tandem-mass spectrometry

S 948

A

1002-6630（2014）21-0234-06

10.7506/spkx1002-6630-201421046

2014-01-14

煙臺(tái)市科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（2012134）；山東省水生動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料泰山學(xué)者崗位資助項(xiàng)目（ts20080208）

田秀慧（1982—），女，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量與安全。E-mail：tianxiuhui127@163.com

*通信作者：宮向紅（1968—），女，研究員，學(xué)士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量與安全。E-mail：ggxxhh123@163.com