蘭小淞，呂延成*

（遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041）

碳納米管技術在食品安全檢測中的應用進展

蘭小淞，呂延成*

（遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041）

隨著國家和人民對食品安全越來越重視，各種食品安全檢測理論和方法不斷涌現(xiàn)，以滿足不同場合需求，同時往往伴隨著特殊材料和新技術的運用。碳納米管（carbon nanotubes，CNT）的運用出現(xiàn)在多學科領域，展現(xiàn)了其優(yōu)良特性和運用前景，其在食品安全檢測中的運用可分為兩大類：一類是將碳納米管整合于傳統(tǒng)食品安全檢測技術中；另一類是開發(fā)基于碳納米管的生物傳感器。碳納米管在食品安全檢測領域的應用使得檢測方法和技術自動化、微型化，具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、生產(chǎn)成本低、壽命長、效率高、快速等特點。

食品安全檢測；碳納米管；生物傳感器

碳納米管（carbon nanotubes，CNT）是由呈六邊形排列的碳原子構成數(shù)層到數(shù)十層同軸圓管，可看作石墨烯片層繞中心軸卷曲而成的中空無縫管體，因此按照石墨烯片的層數(shù)可分為單壁碳納米管（single-wall carbon-nanotubes，SWCNT）和多壁碳納米管（multi-wall carbon-nanotubes，MWCNT）兩種型式。其物理結構穩(wěn)定且具有優(yōu)良的一維導電性、電催化活性、近紅外熒光特性及毛細管效應等。因不溶于任何溶劑，通常以兩種運用途徑呈現(xiàn)：一種是以非共價鍵結合表面活性劑、核酸、多肽、多聚物或者寡聚體；另一種是通過在其表面或頂端連接有機分子使CNT共價功能化，由于側鏈分子間的相互排斥作用使其分散。比如共價連接的羥基側鏈可以進一步與多肽、蛋白質(zhì)以及核酸等生物大分子相結合。且CNT本身可以非共價鍵結合多肽、蛋白質(zhì)或核酸等作為功能化的修飾基團。這些獨特的性能使得CNT被廣泛應用于復合材料、吸附劑、催化劑載體、微電子器件、納米探針和生物傳感器等領域，其在食品安全檢測中的運用可分為兩大類：一類是將碳納米管整合于傳統(tǒng)食品安全檢測技術中；另一類是開發(fā)基于碳納米管的生物傳感器。

1 CNT技術的分類

1.1 基于CNT的生物傳感器和電極

生物傳感器由生物識別元件和物理傳導元件兩大部分組成。生物識別元件（如酶、抗體、微生物、DNA等）是用于提供獨立或人為構建生物環(huán)境催化大分子反應以產(chǎn)生生物識別信號或電化學信號。物理傳導部分用于輸出生物識別區(qū)域的信號到電子儀器線路中，生物識別區(qū)域的輸出信號有阻抗、電位、電流、電導率以及場效應晶體管的表面電荷等。憑借CNT優(yōu)良的一維導電性，常用于物理傳導部分傳送信號。

由于CNT獨特的空間結構使其具有優(yōu)良的電化學伏安行為，利于促進電化學反應中電子傳遞及部分氧化還原蛋白分子的直接電子轉移，還能對某些物質(zhì)產(chǎn)生特有電化學催化效應。CNT修飾的電極能增強電流響應、降低檢出限，在電催化研究方面具有優(yōu)越性，于是又將CNT制成電極或修飾電極進行研究。

1.2 與其他檢測設備聯(lián)合使用

由于CNT較大的比表面積能大量吸附有機物，有利于富集樣品。由于CNT管道兩端開口的結構特性，形成了天然具有毛細管效應的納米管道，利用其毛細效應可在管腔內(nèi)填充特殊物質(zhì)，從而改變CNT物理特性。比如在管腔內(nèi)填充磁性物質(zhì)，經(jīng)過在磁場中回收吸附有機物的CNT便于富集樣品。再結合其氣相色譜（gas chromatography，GC）、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）等設備進行檢測，從而在源頭上提高檢測靈敏度，可簡化樣品前處理步驟、降低成本。

2 CNT技術在檢測中的應用

2.1 有機農(nóng)藥殘留檢測

有機磷類農(nóng)藥被用于世界范圍內(nèi)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。此類物質(zhì)與神經(jīng)毒性氣體梭曼和沙林有相似的結構，能不可逆抑制乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）活性，特別作用于人和昆蟲的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，造成神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿堆積，干擾肌組織反應使體內(nèi)器官嚴重痙攣致死。

基于有機磷農(nóng)藥對AChE的抑制作用，將AChE固定于CNT表面，制備成生物傳感器用于檢測有機磷農(nóng)藥[1-2]。在類似檢測方法設計方法中一個比較關注的問題是如何真實有效的輸出檢測信號，由于儀器的小型化使得信號傳輸線路更加微小，這也為傳感器設計增加難度。有報道以石墨電極生物傳感器[3]為基礎，直接在石墨電極表面加工形成CNT[4]，這樣形成的CNT突起微電極與石墨基極的連接更加緊密，利于減少電信號傳輸損耗，提高電化學靈敏度。Liu Guozhen等[5]利用微接觸印刷技術將微陣列的單壁碳納米管SWNTs打印于玻碳基底上，從而使生物分子和電極之間的電子傳導更有效。然而對于檢測過程中的信號數(shù)據(jù)處理的準確度也是不可忽視的，Crew等[6]利用神經(jīng)網(wǎng)絡算法協(xié)同AChE酶組成的矩陣傳感器，可快速識別環(huán)境和食品中特定的有機磷農(nóng)藥。有機磷水解酶能直接水解有機磷類化合物產(chǎn)生對硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP），Lee等[7]研究表明CNT修飾的復合物電極對PNP非常靈敏，從而可以間接測定到對氧磷。

一方面，通常情況下大多數(shù)農(nóng)藥殘留大多是微量的，Siriviriyanun等[8]提出對于微量分析物的情況下運用高效、低成本、一次性芯片進行分析。生物傳感器的電催化活性在使得低電勢可被檢測到，特別是電極上的樹突狀結構如納米顆粒、CNT，有利于提高共軛酶的穩(wěn)定性，能在很寬的濃度范圍內(nèi)檢測到有機磷農(nóng)藥。

另一方面，有機農(nóng)藥成分往往復雜多樣，利用CNT的吸附特性，可作為吸附劑制備成固相用于固相萃取技術中，結合氣相色譜和電子捕獲法能同時萃取和測定水樣中多種多氯聯(lián)苯[9-10]。由于中空且兩端未封閉的CNT具有毛細管特性，Du Zhuo等[11]在新型磁性固相萃取法的基礎上向CNT的管道空隙中填充磁性鈷鐵氧體，用于檢測蜂蜜和茶葉中的有機磷農(nóng)藥。分別在蜂蜜和茶中提取到8 種有機磷成分，檢測限在1.3～3.6 ng/L之間，回收率分別為83.2%～128.7%和72.6%～111.0%，樣品之間的相對標準偏差低于6.8%。無溶劑預處理技術靈敏度高，但已經(jīng)商業(yè)化的萃取探頭價格昂貴、工作溫度低、質(zhì)脆易折斷。有報道將CNT制備成探頭[12-13]具有簡化步驟、降低成本、耐高溫、壽命長等優(yōu)點，結合火焰光度檢測和氣相色譜法可進行定性和定量分析，聯(lián)合氣相色譜-質(zhì)譜具有較高的靈敏度和較寬的線性范圍[14-16]。

2.2 食品添加劑

許多研究人員選擇將CNT進行物理和化學方面的改性，以解決CNT在基體中的分散問題。然而在相同條件下MWCNT比SWCNT具有更多缺陷，MWCNT比SWCNT更容易被氧化和切斷，而長徑過短的CNT往往會喪失其優(yōu)異的力學性能和電學性能，因此對其表面修飾是非常必要的。將多壁碳納米管與表面活性劑離子形成復合物膜再修飾玻碳電極，通過伏案特性法檢測蘇丹紅Ⅰ的電化學特性具有高靈敏度[17]。為了使電極材料具有優(yōu)良的特殊性質(zhì)，利用巴基凝膠等將碳納米管制成離子溶液已有大量研究，多種基于CNT組成的復合材料修飾電極不斷涌現(xiàn)，如Pt/CNT[18]、碳納米管離子液體凝膠修飾電極[19-20]、SWNTs和鐵卟啉修飾玻碳電極[21-22]、Nafion?和巰基化多壁碳納米管修飾玻碳電極[23]用于蘇丹紅Ⅰ檢測，Au/ MWCNT修飾電極[24]用于叔丁基羥基茴香醚檢測。

Ozoemen等[25-26]對鈷酞菁修飾SWCNT電極做過大量研究，發(fā)現(xiàn)CNT能促進酞菁和金電極之間電子傳遞[27-28]，孔德靜等[29]通過氨基取代的鈷酞菁修飾CNT，用于檢測食品添加劑香蘭素。近年來相繼報道過許多新型電化學免疫傳感器用于檢測克倫特羅[30-31]（一類β受體激動劑，俗稱瘦肉精），He等[32]制備了無標記電化學免疫傳感器，瘦肉精通過1-3-二甲基氨基丙基-3-乙基碳化二亞胺和N-羥基磺基作為交聯(lián)劑共價連接到MWCNT，附著于玻碳電極。以K3Fe(CN)6作為氧化還原探頭，采用循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安安監(jiān)測免疫系統(tǒng)。當抗瘦肉精的單克隆抗體存在時，[Fe(CN)6]3/4-探頭的峰電流降低。其檢測限為0.32 ng/mL。分子印跡技術修飾電極可以提高檢測特異性[33]，張洪才等[34]采用MWCNT結合分子印跡膜修飾絲網(wǎng)印刷電極[35-36]制備成生物傳感用于直接檢測豬尿液中的克倫特羅。直接檢測活體動物體內(nèi)克倫特羅含量，可從源頭上控制和監(jiān)督肉類制品質(zhì)量。

Talio等[37]用CNT處理過的膜過濾器作為固定支架，用于固相表面羅丹明B的熒光定性判斷。該方法有效增強羅丹明B的熒光信號，經(jīng)單向變化分析，其對咖啡因的檢測線性為1.1～9.7×103μg/L，相關系數(shù)達到0.99。在優(yōu)化條件下檢測限為0.3 μg/L，定量限為1.1 μg/L。

2.3 獸藥

多種獸藥因其廉價、穩(wěn)定、有效而大量用于防治各類家畜傳染性疾病，大多數(shù)獸藥殘留對人體有嚴重毒副作用，故國家對其使用有嚴格規(guī)定和限制。目前最有效的方法是采用GC、HPLC、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用以及免疫試紙等。電化學免疫傳感器同時具有電化學檢測的高靈敏度和免疫傳感器的高特異性，可檢測到樣品中痕量目標物且檢測快速、操作簡單。該過程中為了減少固定抗體后抗原-抗體結合活性降低的程度，在基于CNT的復合物上連接抗體和磁性納米材料，通過一塊磁鐵將整體吸附于傳感器基底面電極，且在移去磁鐵后可沖洗基底面使電極可重復使用[38]。類似方法，如在乙二醇中通過原位高溫分解磁性前體鐵（Ⅲ）和MWCNT將磁性納米顆粒結合于多壁碳納米管表面形成復合材料用于檢測血漿樣品中痕量氟喹諾酮類和喹諾酮類[39]。武云等[40]研究表明羥基化的SWCNT修飾玻碳電極[41]對氯霉素的還原具有良好的電催化作用和電化學特性。國內(nèi)外規(guī)定某些獸藥殘留如甲硝唑在動物源性食品組織中最大殘留量限制為零，由于藥殘留在食品中殘留量少且基質(zhì)復雜，檢測方法關鍵在于獸藥殘留的提取和凈化步驟，所以利用CNT大比表面積和吸附特性，可將CNT作為固相，使用固相萃取技術、固相基質(zhì)分散技術聯(lián)合HPLC/MS等儀器設備，有研究者運用該方法對牛奶、雞蛋及蜂蜜中的磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類和四環(huán)素類共52 種獸藥殘留進行檢測[42-45]。

2.4 亞硝酸鹽

亞硝酸鹽問題在我國食品工業(yè)中一直存在，特別是傳統(tǒng)腌臘食品中的含量尤為突出。在亞硝酸鹽檢測中電化學方法比較常用，其電極形式也多樣化，其日益復雜的修改方式趨向于以非共價電聚合使其官能化，使生物大分子體系結構的功能得以表現(xiàn)。如將多血紅素亞硝酸還原酶固定于SWCNT表面能加強電子傳遞[46]，CNT/聚香蘭素復合膜對亞硝酸鹽的電化學氧化具電催化活性[47]。也有將肌紅蛋白、細胞色素C、Cu/Zn-SOD、四（3-三氟甲基苯氧基）酞菁鈷（Ⅱ）制備成基于CNT的生物傳感器用于檢測亞硝酸鹽[48-51]。Wang Cun等[52]將鐵（Ⅲ）卟啉修飾的CNT功能化電極，能同時檢測抗壞血酸、多巴胺、尿酸和亞硝酸根離子（NO2-）。

也有較多報道利用無機化合物的物理及生化特性制備成生物傳感器，如PTH/CNT/GCE[53]、Cu/CNT/CS/ GCE[54]、La-MWCNT/GCE[55]、DNA-CNT/Cu2+/GCE[56]修飾的玻碳電極用于檢測亞硝酸鹽。宋詩穩(wěn)[57]等以CNT修飾的復合陶瓷碳電極作為基礎電極，結合聚吡咯/亞鐵氰化鉀片復合膜[58-59]，用于檢測水樣中NO2-。Afkhami等[60]構建了金納米顆粒/MWCNT/碳陽電極，研究表明該修飾電極具有電催化活性，在亞硝酸鹽氧化過程中產(chǎn)生很高的電流峰，遠遠高于無MWCNT修飾的電極，其線性范圍為0.05～250.0 μmol/L濃度范圍內(nèi)，靈敏度為0.4177（μA·L）/μmol，檢測限為1×10-2μmol/L。Zhang Di等[61]以靜電層層自組裝技術用Dawson鎢磷酸鹽（α2-K7P2VW17O62·18H2O，P2W17V）和CNT制備了一種亞硝酸傳感器，采用循環(huán)伏安法和電化學阻抗譜揭示CNT和P2W17V在復合膜上協(xié)同促進電極傳輸，具有較強的電催化活性。

2.5 微生物

食源性疾病主要由金黃色葡萄球菌腸毒素所致，傳統(tǒng)方法采用ELISA進行分析。Yang Minghui等[62]將抗體以靜電方式吸附于CNT表面，然后固定于聚碳酸酯薄膜，用于監(jiān)測金黃色葡萄球菌腸毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）。結果表明使用CNT可提高6 倍的靈敏度，降低檢測限。Suehiro等[63]研究了利用CNT作為氣體探測器的生物微機電系統(tǒng)，在空氣中將細菌加熱產(chǎn)生NH3，以檢測氨氣來達到檢測細菌的目地。也有研究者先將MWCNT羥基化，再利用大腸桿菌的多克隆抗體使其功能化，進而沉積于金電極表面制備成免疫傳感器，并采用循環(huán)伏安法和阻抗譜檢測分析大腸桿菌[64]。

增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）檢測可以顯著增強免疫分析靈敏度，但通常需要復雜而昂貴的檢測器。這些檢測器限制了ECL在免疫分析中的廣泛運用。為了使ECL能更具實用性，Yang Minghui等[65]借助一個簡單的低溫電耦合感光元件（charge-coupled device，CCD）作為檢測器，并利用CNT將抗體固定，制備成一個簡單、便攜、易維護的免疫傳感器。聯(lián)合ECL、CNT、CCD技術檢測食物中SEB。分別檢測豆?jié){、蘋果汁和肉類食品中SEB的檢測限為0.01 ng/mL，與使用熒光檢測器所檢測到的檢測限處于相當水平。且其檢測限為1 ng/mL，其靈敏度遠遠超過常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法。

2.6 水質(zhì)中酚類化合物及重金屬

Kueseng等[66]研究了一種新型薄膜，將羧基化的MWCNT和聚二甲基硅氧烷涂層形成復合膜作為96 片固相微萃取系統(tǒng)的固相，隨后使用HPLC聯(lián)合紫外檢測進行分析。對3 種酚類化合物的梯度溶液中提取率為64%～90%，相對標準偏差≤6%，檢測限在1～2 μg/L，該方案簡化了傳統(tǒng)檢測方法。Wang Jiaqin等[67]研究了一種新的微流體芯片加上近紅外熒光監(jiān)測用于分析痕量Hg2+，Hg2+引起纏繞在SWCNT上的無標記單鏈DNA解散和聚合，從而導致SWCNT的近紅外熒光變化，此高效微流體芯片能靈敏地檢測出溶解在水中的Hg2+。

2.7 轉基因食品檢測

隨著基因工程技術的高速發(fā)展，利用轉基因生物生產(chǎn)食品越來越普遍，轉基因食品具有人為設計的眾多優(yōu)點，但同時也存在一些潛在的風險。目前國內(nèi)市場上出現(xiàn)的轉基因食品大多都未進行標示和說明其來源。所以目前只能在得知轉基因物種所攜帶人為加入的特異性基因片段序列的前提下，對食品中DNA或RNA進行檢測，以判定其是否屬于轉基因食品。在此涉及到多檢測目標，所以具高通量特性的基因芯片成為首選，但其造價昂貴。其中一種簡便方法是將DNA探針固定于CNT陣列，當探針捕獲靶基因后，利用電化學方法探測鳥嘌呤核苷酸的電化學特性，實現(xiàn)對多種目的基因的快速檢測。周娜等[68]報道過基于MWCNT的納米Ag-TiO2復合膜制備的DNA電化學傳感器，對轉基因玉米的外源性草丁膦乙酰轉移酶基因片段進行檢測，線性范圍為1.0×10-11～1.0×10-6mol/L，檢測限為3.12×10-12mol/L。也有報道通過磷光量子點和碳納米管之間的熒光能量轉移檢測DNA，具有低檢測限和高選擇性[69]。

3 結 語

盡管基于酶抑制的生物傳感器很靈敏但也有許多局限性，如神經(jīng)毒素抑制AChE酶活性，不僅包括有機磷類農(nóng)藥還包括許多其他的化合物，故只能得出綜合毒性，但此分析工具不具有選擇性，無法定量分析檢測脫毒過程中的單獨或一類農(nóng)藥?？紤]到反應活性/重現(xiàn)性，在有些場合需要重復使用，然而大多都是不可逆的反應。

由于CNTs的一些本質(zhì)缺陷，如無修飾的情況下很難溶于任何溶劑中。MWCNTs比SWCNTs更容易被氧化和切斷。雖然在某些運用中表現(xiàn)出優(yōu)異的特性，但需要復雜的物理、化學修飾過程，也增加不少了的工作量。

基于CNTs的基因傳感器能檢測到DNA雜交所產(chǎn)生的信號，具有低檢測限的特點，但值得考慮的是傳感器響應時間問題，通常需要30～60 min才能檢測到雜交信號或者更長。特別，如果在檢測前DNA需要進行聚合酶鏈式反應擴增樣本，那么一般13 個循環(huán)后總時間會更長。

基于CNTs的生物傳感器技術在飛速發(fā)展，越來越多研究和探索得益于將CNTs運用到生物傳感器中。然而CNTs的催化和電學特性還有待開發(fā)，在信噪比方面還有待提高。各式各樣基于CNTs的傳感器不斷被報道，它們各有所長。在各種傳感器、電極或方案改進的同時，它們大都是功能互補的，如果能將不同功能的電極或方案整合到一個電極或芯片上，并協(xié)同發(fā)揮各自優(yōu)勢，也許能夠得到多功能化的生物傳感器。

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Recent Applications of Carbon Nanotube Technology in Food Safety Detection

LAN Xiao-song, Lü Yan-cheng*
(Zhuhai Campus, Zunyi Medical College, Zhuhai 519041, China)

With the increasing attention paid by the country and its people to food safety, various principles and techniques for food safety detection have continued to be developed to meet the requirements of different occasions usually by combination with special materials or new techniques. Carbon nanotube technology (CNT) has seen wide applications in multidisciplinary fields with excellent performance and promising prospects. Its applications in food safety detection are summarized in two aspects: integration with traditional detection technologies for food safety and development of biosensors based on carbon nanotubes. Accordingly, automatic and micro-dimensional food safety detection techniques have been developed with the advantages of high sensitivity, stability, low costs, long lifespan, high efficiency, rapidity, etc.

food safety detection; carbon nanotube technology (CNT); biosensor

TS207

A

1002-6630（2014）21-0344-06

10.7506/spkx1002-6630-201421065

2013-11-29

蘭小淞（1990—），男，碩士研究生，研究方向為腫瘤分子生物學。E-mail：eupatorium@sina.com

*通信作者：呂延成（1961—），男，副教授，博士，研究方向為腫瘤分子生物學。E-mail：yjskyb@163.com