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        微小毛霉凝乳酶基因的定點(diǎn)突變及突變菌株的篩選

        2015-12-16 07:44:06王茜王昕張杰李倬林李鐵柱
        中國乳品工業(yè) 2015年2期
        關(guān)鍵詞:凝乳酶毛霉凝乳

        王茜,王昕,張杰,李倬林,李鐵柱

        (1.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,長春130022;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,長春130124)

        0 引言

        干酪是我國乳制品工業(yè)新的增長點(diǎn),凝乳酶是干酪產(chǎn)業(yè)的核心原料,其品質(zhì)決定了干酪的品質(zhì)。世界干酪生產(chǎn)中所使用凝乳酶約30%為微生物來源的基因工程凝乳酶[1-2]。

        我國干酪生產(chǎn)所使用的高品質(zhì)凝乳酶基本依賴進(jìn)口,國產(chǎn)凝乳酶主要從小牛皺胃中獲得,來源不穩(wěn)定且成本較高。開發(fā)成本低、生產(chǎn)周期短的基因工程凝乳酶對(duì)于我國干酪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義[3-5]。然而,微生物來源的基因工程凝乳酶普遍具有水解專一性差和熱穩(wěn)定性過高的缺陷[6-8]。

        本研究針對(duì)前期構(gòu)建的微小毛霉凝乳酶表達(dá)載體[9,10],依托計(jì)算機(jī)輔助分子模擬技術(shù)確定了突變位點(diǎn)Thr218(第218位蘇氨酸)和Leu287(第287位亮氨酸)[11],通過生物工程技術(shù)實(shí)施分子改造,旨在獲得更適于干酪加工的基因工程凝乳酶。

        1 實(shí)驗(yàn)

        1.1 材料

        1.1.1 菌種及培養(yǎng)基

        巴斯德畢赤酵母GS115,大腸桿菌DH5α,重組微小毛霉凝乳酶質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

        LLB培養(yǎng)基(胰蛋白胨1%,酵母浸提物0.5%,NaCl 0.5%,瓊脂粉1.5%);YPD酵母培養(yǎng)基(酵母浸提物1%,蛋白胨2%,葡萄糖2%,瓊脂粉2%)。均為質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同。

        1.1.2 試劑和儀器

        PrimeSTAR HS DNA Polymerase,限制性內(nèi)切酶,DNA marker,其他試劑為國產(chǎn)分析純。

        1.2 方法

        1.2.1 凝乳酶基因定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)

        微小毛霉凝乳酶基因定點(diǎn)突變方法采用PCR介導(dǎo)的一步法突變技術(shù)。根據(jù)PCR介導(dǎo)的一步法定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)原則,利用primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件,設(shè)計(jì) Thr218Ser(T218S)、Thr218Ala(T218A)、Leu287Gln(L287G)三對(duì)含預(yù)定突變的完全互補(bǔ)的寡核苷酸引物,送生工生物上海股份有限公司合成,如表1所示。

        表1 定點(diǎn)突變所用引物

        1.2.2 凝乳酶基因定點(diǎn)突變PCR反應(yīng)

        以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的重組微小毛霉凝乳酶質(zhì)粒為模板,及PrimeSTAR HS DNA Polymerase高保真聚合酶,分別用3對(duì)引物對(duì)目的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變。PCR反應(yīng)中各物質(zhì)及含量如表2所示。

        表2 PCR反應(yīng)體系

        表2中,PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性10 s,68 ℃退伙延伸5 min;18次循環(huán);72 ℃后延伸8 min。

        本研究通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定PCR反應(yīng)中的模板DNA的質(zhì)量濃度,以保證在PCR成功擴(kuò)增的同時(shí),模板質(zhì)粒能被DpnI酶完全消化,提高突變效率。選擇的模板質(zhì)量濃度分別為20,30,40和50 μg/mL。PCR結(jié)束后取10 μL上樣進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

        1.2.3 突變結(jié)果驗(yàn)證

        采用寶生物公司的mix酶及微小毛霉凝乳酶基因通用引物α-Factor(TACTATTGCCAGCATTGCTGC)3`AOX1(GCAAATGGCATTCTGACATCC)進(jìn)行突變質(zhì)粒的擴(kuò)增,質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和NotI酶切后DNA電泳,完成PCR擴(kuò)增目的基因和雙酶切初步驗(yàn)證。

        PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min;然后94℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s;共進(jìn)行31個(gè)循環(huán);72℃后延伸10 min。雙酶切及PCR鑒定結(jié)果正確的質(zhì)粒,送生工生物上海股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

        1.2.4 重組子的篩選

        質(zhì)粒DNA的線性化有利于提高轉(zhuǎn)化效率和與酵母基因組DNA組整合效率。SacI酶切后可與酵母基因組DNA發(fā)生單交換可提高轉(zhuǎn)化拷貝數(shù)。設(shè)定質(zhì)粒濃度梯度,來確保質(zhì)粒DNA完全線性化。之后采用乙醇沉淀法將線性化的質(zhì)粒濃縮后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母中,分別挑取平板上30個(gè)單克隆轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)接入15 mL YPD培養(yǎng)基中,30℃,200 r/min,培養(yǎng)30 h后,每隔24 h向培養(yǎng)基中加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%甲醇至終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%,連續(xù)誘導(dǎo)96 h。轉(zhuǎn)速為10 000 r/min,離心1 min,取上清,得粗酶液。

        篩選指標(biāo)分別為凝乳酶水解活力(P),凝乳活力與水解活力比值(C/P比值)及熱穩(wěn)定性,具體測(cè)定方法如下:

        凝乳活性(C)的測(cè)定:采用改進(jìn)的MAGDA方法[12];

        水解活力(P)的測(cè)定:采用中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶活力測(cè)定法SB/T10317-1999;

        熱穩(wěn)定性的篩選方法:將待測(cè)樣品分別放在45℃溫度下保溫120 min,每隔10 min取樣,冰浴冷卻,在35℃下測(cè)定微小毛霉凝乳酶的剩余凝乳酶活力;以相對(duì)凝乳活力(凝乳酶加熱后與加熱前活力比值)為縱坐標(biāo),以加熱時(shí)間為橫坐標(biāo),做改造前后凝乳酶熱穩(wěn)定性比較圖。

        2 結(jié)果

        2.1 凝乳酶基因定點(diǎn)突變PCR反應(yīng)

        提取重組微小毛霉出發(fā)菌株質(zhì)粒作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。T218S,T218A,L287G的目的片段長1283bp,載體約3.6 kb,目的基因加載體總長度約4.9 kb,模板梯度稀釋,突變擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出,T218A模板質(zhì)量濃度在20,30,40 μg/mL均擴(kuò)增出清晰、明亮條帶。T218S模板質(zhì)量濃度在30 μg/mL和40 μg/mL擴(kuò)增出條帶清晰PCR產(chǎn)物。L287G模板質(zhì)量濃度在40 μg/mL擴(kuò)增出條帶清晰明亮,無拖尾現(xiàn)象,與預(yù)期長度1283 bp相同,即為實(shí)驗(yàn)所需。結(jié)果表明,在這四個(gè)模板濃度范圍內(nèi),三個(gè)突變PCR反應(yīng),均能得到所需PCR產(chǎn)物。隨著模板濃度的增加,PCR產(chǎn)物的亮度也有所增加,顯示產(chǎn)物的濃度也相繼增加,但是,根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果,同時(shí)為了保證突變的成功率,分別選擇T218A模板質(zhì)量濃度為20 μg/mL,T218S的模板質(zhì)量濃度為30 μg/mL,L287G的模板質(zhì)量濃度為40 μg/mL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用于DpnI酶切。

        圖1 不同模板濃度進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR的擴(kuò)增結(jié)果

        圖1中,M為D15000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),1為模板質(zhì)量濃度40 μg/mL,2為模板質(zhì)量濃度30 μg/mL,3為模板質(zhì)量濃度20 μg/mL,4為模板質(zhì)量濃度10 μg/mL。取上述PCR產(chǎn)物和同PCR產(chǎn)物中含有相同模板濃度DNA(對(duì)照)經(jīng)DpnI酶切作用,轉(zhuǎn)入大腸肝菌DH5α,涂于含有zeocin的抗性LLB固體選擇培養(yǎng)基,結(jié)果如圖2所示。實(shí)驗(yàn)組T218A,T218S,L287G均出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子,對(duì)照組選擇培養(yǎng)基上未出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子,證明DpnI酶對(duì)模板質(zhì)粒已消除干凈。

        圖2 DpnⅠ消化模板質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌結(jié)果

        2.2 突變結(jié)果驗(yàn)證

        制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,將PCR介導(dǎo)位點(diǎn)一步法突變得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,提取突變質(zhì)粒,經(jīng)PCR及雙酶切(NotI,EcoRI)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果如圖3和圖4所示。由圖3和圖4可以看出,擴(kuò)增片段1,2,3大小約為1.3 kb,與微小毛霉凝乳酶基因片段大小相一致。酶切結(jié)果同樣顯示,1,2,3得到兩條片段分別約為1.3 kb(目的片段)和3.6 kb(表達(dá)載體)。證明目的基因存在于擴(kuò)增后的pPICZα A載體中。

        圖3 PCR驗(yàn)證結(jié)果

        圖4 雙酶切驗(yàn)證結(jié)果

        圖3中,M為D2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),1為T218A突變質(zhì)粒,2為T218S突變質(zhì)粒,3為L287G突變質(zhì)粒。圖4中,M為D15000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),1~3同圖3。

        將PCR、酶切鑒定后正確的質(zhì)粒送至上海生物工程有限公司測(cè)序。利用DNAMAN分子生物學(xué)應(yīng)用軟件將測(cè)序結(jié)果與原始凝乳酶基因和Genebank上已登錄的凝乳酶序列進(jìn)行序列比對(duì),結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出,218位Thr(ACC)突變?yōu)锳la(GCT)和Ser(TCC),287位Leu(CTT)突變?yōu)镚ln(CAA),除突變位點(diǎn)氨基酸突變正確外,未發(fā)生額外突變,證明突變成功。

        圖5 基因突變測(cè)序結(jié)果

        2.3 重組子的篩選

        質(zhì)粒梯度濃度線性化酶切后電泳結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出,質(zhì)粒體積為6 μL和5 μL時(shí),電泳結(jié)果顯示出現(xiàn)兩條條帶,證明質(zhì)粒DNA并沒有完全線性化。當(dāng)質(zhì)粒體積為4 μL和3 μL時(shí),酶切后電泳成單一條帶,大小約為5.0 kb,質(zhì)粒酶切完全,成線性條帶,證明質(zhì)粒DNA已經(jīng)完全線性化。為了提高酵母轉(zhuǎn)化的效率,所以選擇質(zhì)粒DNA體積4 μL,作為SacI酶切作用體積。并將酶切后呈線性化的質(zhì)粒DNA,采用乙醇沉淀法濃縮法得到高濃度的線性化DNA,按照酵母電轉(zhuǎn)化方法將濃縮的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母細(xì)胞中,涂于YPD(含zeocin)抗性平板,30℃靜止培養(yǎng)4 d,如圖7中結(jié)果表明轉(zhuǎn)化效率較高,獲得了較多的轉(zhuǎn)化子。圖6中,M為D15000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);3~6為質(zhì)粒體積分別為3,4,5,6 μL電轉(zhuǎn)化電泳結(jié)果。

        圖6 不同濃度質(zhì)粒線性化結(jié)果

        圖7 電擊轉(zhuǎn)化結(jié)果

        2.3.1 凝乳酶酶學(xué)性質(zhì)篩選

        突變質(zhì)粒T218A,T218S,L287G轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,經(jīng)YPD培養(yǎng)基培養(yǎng),隨機(jī)挑取30個(gè)轉(zhuǎn)化子,在YPD液體培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵96 h,測(cè)定粗酶液凝乳酶活力,蛋白水解活力,計(jì)算C/P比值,最終獲得上述參數(shù)優(yōu)良的轉(zhuǎn)化子各一株。結(jié)果如表3所示。

        表3 突變菌株凝乳特性

        由表3可以看出,T218A突變凝乳酶蛋白水解活性明顯降低最為顯著,但凝乳活性極低,不利于凝乳作用;T218S和L287G突變凝乳酶蛋白水解活性均有降低,同時(shí)二者的C/P比值均有提高,且T218S突變凝乳酶C/P比值提高幅度顯著高于L287G突變凝乳酶。

        2.3.2 凝乳酶熱穩(wěn)定性篩選

        本研究將初篩C/P比值較高的T218S和L287G兩個(gè)突變菌株凝乳酶進(jìn)行熱穩(wěn)定性的復(fù)篩,結(jié)果如圖8所示。由圖8可以看出,T218S和L287G兩個(gè)位點(diǎn)的突變,均使突變凝乳酶熱穩(wěn)定性降低,均低于出發(fā)菌株。相對(duì)于L287G位突變凝乳酶,T218S位突變凝乳酶具有更低的熱穩(wěn)定性。L287G位突變凝乳酶45℃處理60 min后,相對(duì)凝乳活力降到76.4%,經(jīng)同樣熱處理,T218S位突變凝乳酶相對(duì)凝乳活力為62.0%。45℃熱處理20 min后,T218S突變凝乳酶隨著溫度處理時(shí)間的增長,相對(duì)凝乳活力持續(xù)降低,60 min后,凝乳活力降低迅速,120 min達(dá)到約40%。由此可知,T218S突變菌株凝乳酶具有更低的熱穩(wěn)定性。

        圖8 45℃熱處理改造前后微小毛霉凝乳酶的熱穩(wěn)定性

        3 結(jié)論

        本研究在前期研究的基礎(chǔ)上了,設(shè)計(jì)了微小毛霉凝乳酶的分子改造方案,利用生物工程技術(shù)完成了改造工作。比較了改造前后凝乳酶的凝乳活力、蛋白水解活力及熱穩(wěn)定性,最終篩選到了突變體T218S一株,其凝乳活力、水解活力分別為52.35 U/mL和1.8 U/mL,C/P比值為29.03。相對(duì)于其他突變體及改造前微小毛霉凝乳酶,突變體T218S所產(chǎn)凝乳酶凝乳活性及C/P比值較高,熱穩(wěn)性較低,具有一定的應(yīng)用前景。

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