劉克營，鐘浩，郭愛珍，劉朋龍，王亮

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.天潤乳業(yè)股份有限公司，烏魯木齊830000）

0 引言

開菲爾粒是一種天然的發(fā)酵劑，其中乳酸菌最多，其次是酵母菌和醋酸菌[1]。開菲爾粒在發(fā)酵過程中容易造成發(fā)酵不均勻等問題，嚴(yán)重影響了開菲爾的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)[2-3]。而純培養(yǎng)發(fā)酵劑不僅連續(xù)傳代活力不穩(wěn)定，而且易發(fā)生雜菌污染或共生菌群失衡，產(chǎn)品的質(zhì)量不穩(wěn)定，從而使傳統(tǒng)開菲爾飲品難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[4]。而開菲爾粒凍干粉的使用可以有效解決以上難題，因此，開菲爾粒的生產(chǎn)至關(guān)重要。

目前，許多研究從不同的角度分析了不同的因素對開菲爾粒增殖的影響[5-11]，但仍需要不斷的探索和研究。本研究對開菲爾粒發(fā)酵過程中的物理因素、pH值、營養(yǎng)條件進(jìn)行研究，從而找出最佳的開菲爾粒增值條件，擴(kuò)大開菲爾粒凍干粉的生產(chǎn)，促進(jìn)開菲爾產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

純牛奶（市售），低脂牛奶（市售），脫脂牛奶（市售），開菲爾粒，胰蛋白胨LP0037，酵母提取物L(fēng)P0021，蔗糖，乳糖，葡萄糖，氯化鈉。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，KH2PO4為2 g，檸檬二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫80為1mL，MgSO4·7H2O為0.58 g，Mn-SO4·4H2O 為 0.25 g，蒸餾水1000 mL，pH值為6.2～6.4。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.4。

1.3 儀器

SW-CJ系列潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），QYC 200全溫空氣搖床，pH計(jì)，BPMJ-250F型霉菌培養(yǎng)箱，手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，BSA124S-CW電子天平，LSHZ-300型低溫水浴培養(yǎng)箱。

1.4 方法

1.4.1 開菲爾粒的活化

將凍存的開菲爾粒取出，按2%的比例接種到滅菌乳中，在28℃，100 r/min條件下培養(yǎng)，每24 h，測發(fā)酵液的pH值，并將開菲爾粒重新接種到新鮮滅菌乳中。重復(fù)6 d。

1.4.2 開菲爾粒的增殖

1.4.2.1 物理因素對開菲爾粒增值的影響。

（1）清洗攪拌對開菲爾粒增值的影響。將4份滅菌乳放入三角瓶中，然后將開菲爾粒按2%的比例接種到滅菌乳中。①攪拌，100 r/min，28℃條件下,每24 h過濾出開菲爾粒，無菌水沖洗，用無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分稱重。②攪拌，100 r/min，28℃條件下,每24 h過濾出開菲爾粒，用無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分稱重。③不攪拌，28℃條件下,每24 h過濾出開菲爾粒，無菌水沖洗，用無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分稱重。④不攪拌，28℃條件下,每24 h過濾出開菲爾粒，用無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分稱重，最后再次接種到新鮮的滅菌乳中。如此重復(fù)6 d。

（2）開菲爾粒的大小對開菲爾粒增殖的影響。將直徑為大于1 cm、0.5～1 cm和小于0.5 cm的開菲爾粒按2%的比例分別接種到滅菌乳中，100 r/min，28℃條件下培養(yǎng)，每24小時(shí)過濾出開菲爾粒，用無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分稱重。如此重復(fù)6 d。

（3）不同的發(fā)酵條件對開菲爾粒增殖的影響。以發(fā)酵溫度、接種量、攪拌速度、發(fā)酵時(shí)間為因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)（表1），到時(shí)間后，用無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分后稱重，然后再次接種到新鮮的滅菌乳中。如此重復(fù)6 d。

表1 正交實(shí)驗(yàn)（I）

1.4.2.2 pH值對開菲爾粒增殖的影響。

準(zhǔn)備3份活化的開菲爾粒，分別做以下處理：①取一份接種到滅菌乳中，連續(xù)培養(yǎng)3 d不作處理，3 d后取出測定開菲爾粒的質(zhì)量。②取一份接種到滅菌乳中，每天用濃度為0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值至6.45，連續(xù)培養(yǎng)3 d，3 d后取出測定開菲爾粒的質(zhì)量。③取一份接種到滅菌乳中，每天更換培養(yǎng)基，測定開菲爾粒的質(zhì)量，其中培養(yǎng)條件均為30℃，120 r/min。

1.4.2.3 營養(yǎng)成分對開菲爾粒增殖的影響。

（1）不同的培養(yǎng)基質(zhì)對開菲爾粒增殖的影響。將開菲爾粒按2%的比例接種到相同體積的滅菌乳，MRS培養(yǎng)液，LB培養(yǎng)液中攪拌培養(yǎng)，30℃（120 r/min）條件下培養(yǎng)，每24 h過濾出開菲爾粒，用無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分稱重，如此重復(fù)6 d。

（2）不同碳源對開菲爾粒增值的影響。在滅菌乳中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的乳糖、葡萄糖、蔗糖，然后接種開菲爾粒，在最佳的條件下培養(yǎng)，30℃（120 r/min）條件下培養(yǎng)，每24 h過濾出開菲爾粒，無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分后稱重，然后再次接種到新鮮的滅菌乳中，如此重復(fù)6 d。

（3）不同氮源對開菲爾粒增殖的影響。在滅菌乳中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的胰蛋白胨、酵母粉，然后接種開菲爾粒，在最佳的條件下培養(yǎng)，30℃（120 r/min）條件下培養(yǎng)，每24 h過濾出開菲爾粒，無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分后稱重，然后再次接種到新鮮的滅菌乳中，如此重復(fù)6 d。

（4）正交實(shí)驗(yàn)。在上述實(shí)驗(yàn)得到的最佳的條件基礎(chǔ)上，然后以碳源、氮源、脂肪和氯化鈉為因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)（表2），30℃（120 r/min）條件下培養(yǎng)，每24h過濾出開菲爾粒，無菌濾紙吸干開菲爾粒表面水分后稱重，然后再次接種到相應(yīng)的新鮮的滅菌乳中，如此重復(fù)6 d。

表2 正交實(shí)驗(yàn)（II） %

2 結(jié)果與分析

2.1 開菲爾粒的活化

開菲爾粒低溫保存時(shí)，開菲爾粒中菌種活性保持很低的水平，在活化的過程中，菌種的活性逐漸達(dá)到最佳狀態(tài)。由圖1可以看出，隨著活化的進(jìn)行，發(fā)酵液的pH值逐漸降低，當(dāng)開菲爾粒活化4次后，發(fā)酵液pH值在3.9左右波動，這說明開菲爾粒的活化狀態(tài)已達(dá)到最佳狀態(tài)。

圖1 開菲爾粒的活化

2.2 開菲爾粒的增殖

2.2.1 物理因素對開菲爾粒增殖的影響

（1）清洗攪拌對開菲爾粒增值的影響。開菲爾粒表面的清洗可以有效地避免開菲爾粒表面雜菌的污染，而攪拌也可以防止霉菌在開菲爾的表面生長[5]。雖然清洗和攪拌在防止污染方面起到一定的作用，但阻礙了開菲爾粒的增殖。由圖2可以看出，攪拌有利于開菲爾粒的增殖，而清洗不利于開菲爾粒的增殖。

這是由于在攪拌的過程中，加大了發(fā)酵液中的氧氣質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及有利于營養(yǎng)成分分布均勻，從而加快了開菲爾粒中的酵母菌、乳酸菌和醋酸菌的生長，因此攪拌有利于開菲爾粒的增殖[12]。另外，開菲爾粒在增殖的過程中會在開菲爾粒的表面形成一層多糖物質(zhì)，即為開菲爾粒的組成成分，而在清洗的過程中，這種多糖物質(zhì)會被破壞，從而影響開菲爾粒的增殖。所以攪拌不清洗的效果是最好的，七天的培養(yǎng)使開菲爾粒的增殖率達(dá)到106%，增加了一倍。

圖2 攪拌清洗對開菲爾粒增殖的影響

（2）開菲爾粒的大小對開菲爾粒增殖的影響。開菲爾粒是由多糖物質(zhì)、蛋白質(zhì)和各種菌種組成的粒狀發(fā)酵劑，而菌種在開菲爾粒的表面和內(nèi)部都有分布[12-15]。開菲爾粒的增殖過程其實(shí)就是一個(gè)菌種的增殖和多糖物質(zhì)的合成過程，而這個(gè)過程需要開菲爾粒內(nèi)外菌種的共同作用來完成。開菲爾粒的表面積越大，越有利于開菲爾粒內(nèi)部與外部營養(yǎng)物質(zhì)的交流和產(chǎn)物的合成。從而加速菌種的繁殖和多糖物質(zhì)的合成。另外，相同質(zhì)量的開菲爾粒粒徑越小，開菲爾粒的表面積就越大，相反開菲爾粒的表面積就越小。

圖3 粒徑大小對其增殖的影響

由圖3可以看出，開菲爾粒越小開菲爾粒的生長速度越快。當(dāng)開菲爾粒的粒徑小于0.5 cm時(shí)，連續(xù)培養(yǎng)7 d開菲爾粒增長率達(dá)到195.3%，而粒徑超過1 cm的開菲爾粒的增長率只是141.4%。因此，開菲爾粒的大小對開菲爾粒增殖是有影響的，開菲爾粒越小越有利于開菲爾粒的增殖，越大越不利于開菲爾粒的增殖。當(dāng)然也不是越小越好，要符合現(xiàn)實(shí)情況。

（3）不同發(fā)酵條件對開菲爾粒增殖的影響。在已得最佳條件下，進(jìn)行發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、攪拌速度和接種量正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 各因素和接種量正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3可以看出，4種不同的因素對開菲爾粒增殖的影響大小不同，其影響主次順序是發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞攪拌速度＞接種量。通過表3中的極差分析可得出，開菲爾粒的最佳的增殖條件是發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間24 h，攪拌速度為120 r/min，接種量2%。

2.2.2 pH值對開菲爾粒增殖的影響

開菲爾粒發(fā)酵前期，發(fā)酵液中營養(yǎng)成分充足，生長環(huán)境適宜，開菲爾粒中的菌種代謝旺盛，而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，生長環(huán)境逐漸變的惡劣，減緩了菌種的增殖，同時(shí)因?yàn)樗嵝缘脑鰪?qiáng)，抑制了產(chǎn)粘細(xì)菌代謝產(chǎn)生粘性多糖，從而阻礙了開菲爾粒的增殖。由表4可以看出，相同條件下，3處理比1處理的增長率高30.3%，而2和3增長率相差僅6.5%。所以，pH值的變化也是影響開菲爾粒增殖的一個(gè)重要因素。

表4 pH值對開菲爾粒增殖的

2.2.3 營養(yǎng)成分對開菲爾粒增殖的影響

（1）不同培養(yǎng)基質(zhì)對開菲爾粒增殖的影響。由圖4可以看出，不同培養(yǎng)基影響開菲爾粒的增殖。其中滅菌乳是開菲爾粒增殖的最佳培養(yǎng)基，相同培養(yǎng)條件下，在滅菌乳中開菲爾粒的增殖率達(dá)到85%，MRS次之，LB培養(yǎng)基最差。這是由于開菲爾粒中主要包括乳酸菌和酵母菌，LB培養(yǎng)基雖然是基本培養(yǎng)基，但它不是最佳培養(yǎng)基，它只是為微生物提供基本的生存保證，在里面微生物得不到快速繁殖，而MRS培養(yǎng)基是乳酸菌培養(yǎng)基，它有利于乳酸菌的快速增殖，但是它不利于開菲爾粒中酵母菌的增殖，所以開菲爾粒的增殖速度雖然比在LB培養(yǎng)基中高，但還是不能滿足要求。滅菌乳中各種營養(yǎng)成分充足，而且并不對某種菌進(jìn)行選擇性抑制，這使得乳酸菌和酵母菌都能在滅菌乳中進(jìn)行快速繁殖，從而加速開菲爾粒的增殖。因此，在滅菌乳中，開菲爾粒的增殖率最高。

圖4 培養(yǎng)基質(zhì)對開菲爾粒增殖的影響

（2）不同碳源對開菲爾粒增殖的影響。開菲爾粒中菌種的組成是多樣的，而不同的菌種對碳源需求是不同的，本試驗(yàn)取了三種基本的糖（乳糖、葡萄糖、蔗糖），研究不同的糖對開菲爾粒增殖的影響。由圖5可以看出，不是所有的糖對開菲爾粒的增殖有促進(jìn)作用，相同條件培養(yǎng)，乳糖對開菲爾粒增殖有明顯的促進(jìn)作用，葡萄糖對開菲爾粒的增殖的也有促進(jìn)作用，但效果不如乳糖，而蔗糖對開菲爾粒增殖的作用最小，在一定程度上會抑制開菲爾粒的增殖。

圖5 不同碳源對開菲爾粒增殖的影響

圖6 不同碳源對開菲爾粒增殖的影響

（3）不同氮源對開菲爾粒增殖的影響。在培養(yǎng)初期，開菲爾粒中的乳酸菌利用乳中氨基酸和蛋白質(zhì)，快速反應(yīng)，產(chǎn)生大量的酸，從而導(dǎo)致了發(fā)酵液中氨基酸和蛋白質(zhì)的不足，抑制了產(chǎn)粘菌種的繁殖和代謝，進(jìn)而影響了開菲爾粒的增殖[5]。本文以胰蛋白胨和酵母提取物為兩種氮源物質(zhì)，以期選出一種對開菲爾粒增殖最佳的氮源。由圖6可以看出，酵母提取物和胰蛋白胨對開菲爾粒都有促進(jìn)作用，而添加胰蛋白胨的效果比添加酵母提取物的效果要好。這符合Anine Schoevers等的研究成果，他們發(fā)現(xiàn)在促進(jìn)開菲爾粒增殖方面，胰蛋白胨的效果優(yōu)于酵母提取物[6]。

（4）正交實(shí)驗(yàn)。在已得最佳條件下，進(jìn)行脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)、乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、胰蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表5所示。

由表5可以看出，4種不同的因素對開菲爾粒增殖的影響大小不同，其影響主次順序是脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞胰蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。通過表5中的極差分析可得出，開菲爾粒的最佳的增殖條件是脫脂牛奶、乳糖0.5%，胰蛋白胨0.5%和氯化鈉0.8%（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。由此可知，乳糖和胰蛋白胨的添加量并不是越多越好。按正交實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出，開菲爾粒的增殖率最低增加了31.08%，因此可知，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。

表5 脂肪、乳糖、胰蛋白胨和氯化鈉正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 %

圖7 最佳條件下開菲爾粒的增長

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，開菲爾粒在連續(xù)接種培養(yǎng)3天時(shí)達(dá)到最高的活性狀態(tài)，發(fā)酵液的pH值穩(wěn)定在3.9左右。另外，通過對增殖工藝（清洗攪拌，粒徑大?。┖驮鲋硹l件（培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量、攪拌速度）進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)得出，清洗減緩了開菲爾粒的增殖速度，攪拌有利于開菲爾粒的增殖；當(dāng)粒徑小于0.5 cm時(shí)開菲爾粒的增殖速度最快；而且還得出當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間是24 h，攪拌速度為120 r/min和接種量為2%時(shí)，開菲爾粒的增殖速度最大。

另外，研究發(fā)現(xiàn)，相同條件下培養(yǎng)，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值的變化可使開菲爾粒的增長率比不做處理的開菲爾粒的增長率高出23.8%，而這比更換培養(yǎng)基的對照組僅僅低了6.5%。由此可得出，連續(xù)3 d發(fā)酵的過程中，營養(yǎng)成分的變化并不是主要的因素，pH值的變化才是影響開菲爾粒增殖的主要因素。

關(guān)于營養(yǎng)成分對開菲爾粒增殖的影響。通過單因素試驗(yàn)得出，牛奶是開菲爾粒增殖的最佳營養(yǎng)基質(zhì)；胰蛋白胨的效果比酵母粉的效果好；乳糖對促進(jìn)開菲爾粒增殖的效果最好，葡萄糖次之，而添加葡糖糖的效果不明顯，甚至在一定程度上削弱了開菲爾粒的增殖速度。另外，通過正交試驗(yàn)得出，當(dāng)使用脫脂牛奶，胰蛋白胨添加量為0.5%，乳糖添加量為0.5%以及氯化鈉添加量為0.8%時(shí)，開菲爾粒的增殖率最高，接近普通牛奶發(fā)酵增殖率的2倍。

最后，利用所得最佳條件進(jìn)行開菲爾粒的增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，開菲爾粒的增殖率比實(shí)驗(yàn)過程中的最佳水平高出31個(gè)百分點(diǎn)，增殖效果明顯。

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