于瑞星 尹躍平韓 燕 鐘銘英 施美琴 王 琪 龔匡隆

梅毒螺旋體傳代接種對(duì)兔梅毒模型RPR滴度的影響

于瑞星 尹躍平?韓 燕 鐘銘英 施美琴 王 琪 龔匡隆

目的: 明確兔睪丸組織中Tp Nichols菌株傳代接種對(duì)實(shí)驗(yàn)兔血清學(xué)滴度的影響。方法:按照接種Tp菌株代數(shù)的不同，將23只家兔分為原代組(5只)、一代組(9只)、二代組(8只)，空白對(duì)照組(1只)。原代組所接種菌株為保存于液氮的Tp Nichols復(fù)蘇菌株；一代組實(shí)驗(yàn)兔所接種菌株來自于原代組實(shí)驗(yàn)兔腫大睪丸；二代組實(shí)驗(yàn)兔所接種菌株來自于一代組實(shí)驗(yàn)兔腫大睪丸。接種14天后抽取兔耳緣靜脈血并空氣注射致死，對(duì)兔的耳緣靜脈血清進(jìn)行RPR和TPPA檢測(cè)。結(jié)果: 接種后實(shí)驗(yàn)兔全部感染。原代組、一代、二代組RPR滴度≥1∶16的兔比例分別為20%，88.9%，100%，原代組與一代、二代組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.008；P＝0.001)，一代組與二代組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＝0.249)。RPR幾何平均滴度在原代組、一代組、二代組分別為4.0，25.4，76.1，原代組與一代組、二代組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，一代與二代組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)論:在建立梅毒兔實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜁r(shí)，將液氮中保存的Tp Nichols菌株在睪丸組織中傳代接種，可提高實(shí)驗(yàn)兔的梅毒血清學(xué)滴度。

梅毒螺旋體； 新西蘭雄兔； 感染模型

梅毒是最常見的性傳播疾病之一，據(jù)WHO估計(jì)全球每年新發(fā)梅毒患者約1060萬例，1梅毒發(fā)病人數(shù)居乙類傳染病的第三位。目前還沒有預(yù)防控制梅毒的疫苗，有效的抗生素治療是預(yù)防控制梅毒的重要措施之一。青霉素是治療梅毒的一線藥物，但據(jù)報(bào)道一般人群青霉素過敏率為8%～28.1%。2，3頭孢曲松是治療梅毒的替代方案之一，但是目前有關(guān)頭孢曲松治療梅毒的藥物動(dòng)力學(xué)等研究尚未明確。建立標(biāo)準(zhǔn)的兔梅毒感染模型是研究頭孢曲松等藥物治療梅毒機(jī)制的重要前提。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，4在人體治療梅毒血清學(xué)滴度下降4個(gè)單位才能稱為治療有效，如果在兔感染模型中RPR滴度低于1∶16，則給予感染的兔梅毒注射頭孢曲松后，RPR滴度變化幅度較小，不易評(píng)價(jià)頭孢曲松藥治療梅毒的療效。本文的研究目的是觀

察通過接種14天后取睪丸中傳代培養(yǎng)的Tp Nichols菌株立即再次接種是否能夠提高實(shí)驗(yàn)兔血清滴度抗體，為建立梅毒抗菌藥物的藥效評(píng)價(jià)模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 新西蘭雄兔購于江蘇省金陵種兔廠，Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株(美國華盛頓大學(xué)過敏與傳染病實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))；無菌生理鹽水；RPR試劑購于上?？迫A生物工程股份有限公司，TPPA試劑購于珠海麗珠股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液制備 將液氮中低溫保存的Nichols標(biāo)準(zhǔn)株在37℃的培養(yǎng)箱中復(fù)蘇1 h，置于裝有15 mL無菌生理鹽水的燒瓶中剪碎后靜置15 min，取一定量的菌懸液于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于暗視野顯微鏡下計(jì)數(shù)，制備一定濃度的菌懸液(約含梅毒螺旋體107/m L)。

1.2.2 睪丸接種 按照接種Tp菌株代數(shù)的不同，將23只實(shí)驗(yàn)兔分為原代組(5只)、一代組(9只)、二代組(8只)，健康對(duì)照組(1只)。原代組實(shí)驗(yàn)兔所接種菌株為保存于液氮的Nichols復(fù)蘇菌株；一代組實(shí)驗(yàn)兔所接種菌株來自于原代組實(shí)驗(yàn)兔腫大睪丸；二代組實(shí)驗(yàn)兔所接種菌株來自于一代組實(shí)驗(yàn)兔腫大睪丸。具體步驟如下:取體重3.0～3.5 kg的新西蘭雄兔，將其固定在兔實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，擠壓腹部，使其睪丸通過腹壓膨脹，用無菌棉球消毒后，將2 mL菌懸液分別注射致兩側(cè)睪丸，14天后取實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈血并空氣注射致死。

1.2.3 菌株保存 將處死的實(shí)驗(yàn)兔固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，用酒精棉球消毒后靜置1～3 min待酒精揮發(fā)，切開筋膜取出睪丸，置于裝有15 mL無菌生理鹽水燒瓶中，剪碎睪丸后靜置5min，吸取少量菌懸液至載玻片，蓋上蓋玻片，在暗視野顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)螺旋體，制備一定濃度的菌懸液(約含梅毒螺旋體107/mL)，將2 m L菌懸液注射至一代組兩側(cè)睪丸。取出其他腫大的兔睪丸，放置于液氮保存管中，用紗布包扎并標(biāo)記。4℃保存2 h后轉(zhuǎn)移至－20℃保存2～3 h后轉(zhuǎn)移至－70℃冰箱過夜保存，于次日保存于液氮罐中。

1.2.4 TPPA和RPR檢測(cè) 按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行TPPA和RPR檢測(cè)。5

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)RPR滴度的倒數(shù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后計(jì)算幾何平均滴度及95%CI。計(jì)數(shù)資料用t檢驗(yàn)，計(jì)量資料用χ2檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 實(shí)驗(yàn)兔接種時(shí)間、RPR滴度及TPPA實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 三代兔睪丸腫大、TPPA(＋)、RPR(≥1∶16)例數(shù)比較

見表1。其中1只實(shí)驗(yàn)兔作為健康對(duì)照，其睪丸無腫大、RPR(－)、TPPA(－)。22只實(shí)驗(yàn)兔全部感染Tp。原代、一代、二代組間RPR滴度≥1∶16的實(shí)驗(yàn)兔比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝12.299，P＝0.002)，見表2。原代組與一代、二代組相比，其RPR滴度≥1∶16的兔比例較低(χ2＝6.966，P＝0.008；χ2＝11.044，P＝0.001)；一代組RPR滴度≥1∶16的兔比例與二代組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2＝1.327，P＝0.249)。RPR幾何平均滴度在原代組與一代組、原代組與二代組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。一代組與二代組之間RPR幾何平均滴度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

4 討論

上個(gè)世紀(jì)20年代初期就開始進(jìn)行梅毒的動(dòng)物模型研究。在家兔中可形成實(shí)驗(yàn)性梅毒感染，一般認(rèn)為Tp在家兔的實(shí)驗(yàn)感染和人的自然感染有相似之處。6倉鼠和豚鼠可在接種Tp部位發(fā)生損害但不典型；免疫受到抑制的鼠也可被感染，但不易成功。有研究表明，鼠對(duì)Tp的免疫反應(yīng)較家兔慢，甚至難以產(chǎn)生兔免疫反應(yīng)。7考慮到家兔對(duì)Tp的易感性，絕大多數(shù)建立的梅毒動(dòng)物模型主要還是兔感染模型。8－11

在本文中，全部實(shí)驗(yàn)兔在接種14天后感染Tp，說明利用本實(shí)驗(yàn)方法可以成功建立實(shí)驗(yàn)兔梅毒感染模型。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，實(shí)驗(yàn)兔接種Tp后一般14天左右睪丸腫大，經(jīng)暗視野顯微鏡觀察Tp計(jì)數(shù)最多。所以在本研究中，接種14天后抽血檢測(cè)其血清學(xué)滴度，并致死實(shí)驗(yàn)兔，取睪丸組織再次接種。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在人體治療梅毒血清學(xué)下降4個(gè)滴度才可稱為治療有效。4原代組實(shí)驗(yàn)兔在接種Tp Nichols 14天后RPR幾何平均滴度較低，說明在液氮中保存的復(fù)蘇菌株感染實(shí)驗(yàn)兔14天后不宜進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。一代、二代組實(shí)驗(yàn)兔RPR滴度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且兩組RPR幾何平均滴度較高，說明接種14天后取睪丸中傳代培養(yǎng)的Tp Nichols菌株立即再次接種能夠提高實(shí)驗(yàn)兔血清抗體滴度，且建立的兔梅毒感染模型更適合藥效學(xué)評(píng)價(jià)。當(dāng)然本文存在一定的局限性:(1)本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)兔接種14天后沒有進(jìn)行后續(xù)觀察，RPR滴度隨著時(shí)間延長可能會(huì)繼續(xù)上升，RPR滴度在第14天不一定達(dá)到最高值；(2)因?qū)嶒?yàn)兔為體重3.0～3.5 kg的新西蘭雄性健康兔，僅隨機(jī)抽取1只實(shí)驗(yàn)兔抽血進(jìn)行TPPA和RPR實(shí)驗(yàn)排除梅毒感染的可能。

1 Daskalakis D.Syphilis:continuing public health and diagnostic challenges.Curr HIV/AIDSRep，2008，5(2):72－77.

2Macy E.Penicillin and beta－lactam allergy:epidemiology and diagnosis.Curr Allergy Asthma Rep，2014，14:476.

3Khasawneh FA，Slaton MA，Katzen SL，et al.The prevalence and reliability of self－reported penicillin allergy in a community hospital.Int JGen Med，2013，6:905－909.

4王千秋，劉全忠，徐金華，等.性傳播疾病臨床診療與防治指南.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2014.86－87.

5尹躍平.性病防治培訓(xùn)手冊(cè)—實(shí)驗(yàn)室檢測(cè).北京:人民衛(wèi)生出版社，2011.17－25.

6 Lukehart SA，Marra CM.Isolation and laboratorymaintenance of Treponema pallidum.Curr Protoc Microbiol，2007，12:12A.1.

7Saunders JM，F(xiàn)olds JD.Humoral response of themouse to Treponema pallidum.Genitourin Med，1985，61(4):221－229.

8 Zhao F，Liu S，Zhang X，etal.CpG adjuvantenhances themucosal immunogenicity and efficacy of a Treponema pallidum DNA vaccine in rabbits.Hum Vaccin Immunother，2013，9(4):753－760.

9 ZobaníkováM，Mikolka P，CejkováD，et al.Complete genome sequence of Treponema pallidum strain DAL－1.Stand Genomic Sci，2012，7(1):12－21.

10 Fitzgerald TJ.Effects of cefetamet(Ro 15－8074)on Treponema pallidum and experimental syphilis.Antimicrob Agents Chemother，1992，36(3):598－602.

11 Lukehart SA，Baker－Zander SA，Holmes KK.Efficacy of aztreonam in treatment of experimental syphilis in rabbits.Antimicrob Agents Chemother，1984，25(3):390－391.

(收稿:2014－08－05 修回:2014－12－07)

Effect of Treponema pallidum continuous passage inoculation in rabbitsmodel on RPR titer

YU Rui-xing，YIN Yue-ping，HAN Yan，et al.Institute ofDermatology，Chinese Academy ofMedical Sciences，Nanjing，210042

Objective:To determine the effectof Treponema pallidum(Tp)of continuous passage inoculation in rabbits on RPR titer.M ethods:Twenty three New Zealand male rabbitswere divided into the primary group(5 rabbits)，the first generation group(9 rabbits)，the second generation group(8 rabbits)and the blank control group(1 rabbit).In the primary group，the testicles of rabbits were inoculated with Nichols strains stored in liquid nitrogen container.In the first generation group，the testicles of rabbitswere inoculated with the strains from the rabbits of the primary generation group.In the second generation group，the testicles of rabbitswere inoculated with the strains from the rabbits of the first generation group.The levels of RPR and TPPA in blood sera from earmargin veinswere detected after 14 days of the inoculation.Results:All the inoculated rabbitswere infected by Tp.The rates of the rabbitswith RPR titermore than or equal to 1∶16 in the primary group，the first generation group and the second generation group were 20%，88.9%and 100%.And the RPR geometricalmean in the primary group，the first generation group and the second generation group were 4.0，25.4 and 76.1.Conclusion:The serum titers of Tp increased in rabbits of continuous passage inoculation.

Treponema pallidum；New Zealand male rabbit；infection model

國家十一五“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項(xiàng)“防治性病對(duì)預(yù)防艾滋病的作用研究”(編號(hào): 2008ZX10001－005)

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所，南京，210042?通信作者