王曉， 黃曉平， 黎玲， 刁勇

(1. 華僑大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 福建 泉州 362021；2. 泉州師范學(xué)院 化工與材料學(xué)院， 福建 泉州 362000)

重組腺相關(guān)病毒(rAAV)是一種無(wú)包膜的單鏈DNA病毒，因自身復(fù)制缺陷、基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、免疫原性小等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是目前最安全的基因治療載體之一[1-2].近年來(lái)，rAAV載體作為基因治療載體已在遺傳性疾病、癌癥、干細(xì)胞和神經(jīng)退行性疾病等研究中取得了顯著的治療效果[3-6].目前，世界范圍內(nèi)有100余項(xiàng)以rAAV為載體的基因藥物已完成或正在進(jìn)行臨床研究[7].2017年12月，治療遺傳性視網(wǎng)膜病變的基因藥物L(fēng)uxturna上市[8]，這給基因治療帶來(lái)了美好前景.然而，規(guī)?；苽浜唾|(zhì)量控制等因素制約了rAAV在臨床上的應(yīng)用，尤其是缺少準(zhǔn)確、可靠的rAAV滴度定量標(biāo)準(zhǔn)方法，這使不同實(shí)驗(yàn)室的rAAV劑量由于缺少參比標(biāo)準(zhǔn)而無(wú)法進(jìn)行歸一化處理.

rAAV滴度分為衣殼滴度、基因組滴度、轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度和感染滴度等.目前，臨床劑量通?；趓AAV 載體的基因組滴度，準(zhǔn)確地定量載體是藥物獲得最大療效和最小毒性的前提條件[9]，也是不同工藝和不同廠家產(chǎn)品橫向比較的依據(jù)[10-11].實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)是常用的rAAV基因組滴度測(cè)定法，但傳統(tǒng)的Q-PCR具有適用范圍窄、易產(chǎn)生系統(tǒng)性誤差和易受雜質(zhì)干擾等缺點(diǎn)[11-12]；采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法測(cè)定衣殼滴度的價(jià)格昂貴，且無(wú)法區(qū)分空心病毒；轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度受轉(zhuǎn)基因和細(xì)胞的限制，不具有普適性；感染滴度測(cè)定需要腺病毒輔助，再提取細(xì)胞DNA，通過(guò)Q-PCR測(cè)定病毒基因組拷貝數(shù)，測(cè)定過(guò)程繁瑣，尚未廣泛得到應(yīng)用.腺相關(guān)病毒參比標(biāo)準(zhǔn)事務(wù)委員會(huì)推薦ELISA，Q-PCR，半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)等方法一起使用，作為rAAV 檢定的測(cè)量方法[13].由于TCID50的測(cè)量過(guò)程繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，故采用轉(zhuǎn)導(dǎo)方法代替TCID50.基于此，本文采用ELISA，Q-PCR和轉(zhuǎn)導(dǎo)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室制備的rAAV進(jìn)行定量.

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞株

質(zhì)粒pCMV-ITR-GFP，pH22，pdf6為實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)胞株293T購(gòu)自美國(guó)模式菌種收藏中心(ATCC).

1.2 主要試劑

Real-time PCR試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher公司)；AAV2 Titration ELISA試劑盒(德國(guó)PROGEN Biotechnik公司)；RNase(北京市莊盟生物科技公司)；氯化銫(德國(guó)Sigma公司)；Benzonase(德國(guó)Merk公司)；聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI，美國(guó)Polysciences公司)；DMEM，1640培養(yǎng)基和胎牛血清(美國(guó)Gibco公司).

1.3 rAAV的制備

參照實(shí)驗(yàn)室建立的制備rAAV方法，當(dāng)293T細(xì)胞密度為85%時(shí)，進(jìn)行三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒與PEI按照質(zhì)量比為1∶3進(jìn)行混合，靜置后加入293T細(xì)胞中；72 h后收獲病毒，進(jìn)行氯化銫梯度離心分離、透析和濃縮，制備rAAV，共制備3批rAAV，后續(xù)實(shí)驗(yàn)每批重復(fù)3次.

1.4 ELISA測(cè)定rAAV衣殼滴度

采用AAV2 Titration ELISA試劑盒對(duì)rAAV進(jìn)行定量.首先，將試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至107～109P·mL-1范圍內(nèi)，以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度的對(duì)數(shù)值(lgCs)為橫坐標(biāo)，以其光密度的對(duì)數(shù)值(lgD)為縱坐標(biāo)，繪制rAAV標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1).然后，將rAAV2原液進(jìn)行稀釋?zhuān)凑照f(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀讀取光密度D450，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算rAAV2衣殼滴度.

圖1 rAAV標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5 Q-PCR測(cè)定rAAV基因組滴度

以GFPF5′-GAGCGCACCATCTTCTTCAA-3′；GFPR5′-TCCTTGAAGTCGATGCCCTT-3′為引物，以SYB-R Green為染料，反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為94 ℃變性20 s，60 ℃退火延伸40 s，40個(gè)反應(yīng)循環(huán).

1.6 轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度的測(cè)定

制備293T細(xì)胞懸液密度為1×105個(gè)·mL-1，按照100 μL·孔-1接種至96孔板，待細(xì)胞貼壁后加入rAAV；取10 μL病毒原液，按10倍進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?0 μL稀釋后的rAAV加入96孔板中；4 h后，更換為新鮮培養(yǎng)液并添加丁酸鈉；24 h后，觀察熒光表達(dá)情況，在最高稀釋梯度的孔中計(jì)算綠色熒光細(xì)胞數(shù)目，可得rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度.

2 結(jié)果與分析

2.1 rAAV衣殼滴度

rAAV標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.915x-8.032，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算3批包裝、純化的rAAV的衣殼滴度，結(jié)果如表1所示.表1中：SD為標(biāo)準(zhǔn)差.由表1計(jì)算可知：3批rAAV平均衣殼滴度為3.65×1013P·mL-1；不同批次制備得到的rAAV產(chǎn)量相差2倍左右，這是因?yàn)閞AAV在制備過(guò)程中受到細(xì)胞狀態(tài)、數(shù)目、轉(zhuǎn)染條件和純化工藝等的影響.

表1 不同批次的rAAV衣殼滴度

2.2 rAAV基因組滴度

以質(zhì)粒pAMG-EGFP為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制Q-PCR擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示.圖2中：ΔRn為產(chǎn)物的熒光值；C為循環(huán)次數(shù)；Ct為擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，熒光值對(duì)應(yīng)的PCR循環(huán)次數(shù)；R2=0.998.依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算3批rAAV基因組滴度，結(jié)果如表2所示.由表2計(jì)算可知：3批rAAV平均基因組滴度為8.67×1011GC·mL-1.ELISA方法測(cè)得的rAAV不僅包括實(shí)心病毒、空心病毒，還包括不完整病毒.因此，ELISA測(cè)定的衣殼滴度一般比基因組滴度大，衣殼滴度與基因組的比值P/GC能體現(xiàn)rAAV在包裝和純化過(guò)程中的工藝優(yōu)劣.腺相關(guān)病毒參比標(biāo)準(zhǔn)事務(wù)委員會(huì)推出AAV2標(biāo)準(zhǔn)品的P/GC為28，而實(shí)驗(yàn)室制備的3批rAAV的P/GC分別為42.16，40.33，42.61(平均值為41.70)，與AAV2標(biāo)準(zhǔn)品的P/GC較為接近.

(a) Q-PCR擴(kuò)增曲線 (b) Q-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 不同批次的rAAV基因組滴度

2.3 rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度

以感染復(fù)數(shù)(MOI)為250∶1，500∶1，1 000∶1分別轉(zhuǎn)導(dǎo)Hela細(xì)胞，其熒光表達(dá)情況，如圖3所示.由圖3可知：隨著MOI增大，表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)目增多.rAAV經(jīng)過(guò)稀釋后轉(zhuǎn)導(dǎo)293T細(xì)胞，觀察表達(dá)GFP細(xì)胞數(shù)目，統(tǒng)計(jì)分析得到rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度，如表3所示.由表3計(jì)算可知：3批rAAV平均轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度為9.85×109TU·mL-1.基因組滴度與轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度的比值GC/TU可反映rAAV的轉(zhuǎn)染、親嗜和表達(dá)能力的優(yōu)劣，GC/TU越小，則能力越強(qiáng).腺相關(guān)病毒參比標(biāo)準(zhǔn)事務(wù)委員會(huì)推出AAV2標(biāo)準(zhǔn)品的GC/TU為64.4，實(shí)驗(yàn)室制備的3批rAAV的GC/TU分別為88.45，88.58，87.58(平均值為88.20)，與AAV2標(biāo)準(zhǔn)品的GC/TU較為接近.

(a) MOI=250∶1 (b) MOI=500∶1 (c) MOI=1 000∶1

表3 不同批次的rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度

3 討論

目前，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)rAAV滴度定量采用Q-PCR方法，但Q-PCR只能測(cè)定rAAV包裹的基因組，無(wú)法測(cè)定空殼rAAV，而空殼rAAV不僅不會(huì)表達(dá)轉(zhuǎn)基因，反而會(huì)引起免疫反應(yīng)[14-20].文中利用ELISA，Q-PCR和轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，分別測(cè)定rAAV的衣殼滴度、基因組滴度和轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度，并計(jì)算其P/GC平均值為41.70，GC/TU平均值為88.20，這與AAV2標(biāo)準(zhǔn)品的P/GC，GC/TU較為接近[21]，表明制備的rAAV質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng).

rAAV基因藥物的臨床研究已充分證實(shí)其具有有效性和安全性，但臨床試驗(yàn)仍發(fā)現(xiàn)rAAV衣殼蛋白會(huì)引起嚴(yán)重的細(xì)胞免疫毒性.建立完整的rAAV基因藥物的質(zhì)量控制體系，降低免疫反應(yīng)，需要保證rAAV轉(zhuǎn)基因藥效的同時(shí)盡量減少劑量[16]，這要求rAAV的純度高、空殼少、親嗜性高.單一的基因組滴度或轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度無(wú)法反映rAAV的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，因此，在rAAV質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立時(shí)，需要測(cè)定rAAV的衣殼滴度、基因組滴度和轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度，文中研究為rAAV質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了一種新的思路.