朱國光(淮安市第一人民醫(yī)院分院，淮安市耳鼻喉醫(yī)院藥劑科，江蘇淮安 223002)

單磷酸阿糖腺苷屬于人工合成的嘌呤核苷酸類化合物，是阿糖腺苷的磷酸化產物，臨床上主要用于治療皰疹病毒和肝炎病毒感染所致的皮炎、口炎、腦炎和巨細胞病毒感染等疾病［1-4］。目前，其質量標準采用國家食品藥品監(jiān)督管理總局“新藥轉正標準第27冊”，標準編號:WS1-(X-061)-2001Z，但未對其有關物質的測定進行相關規(guī)定。為貫徹藥品質量安全、有效、可控的目標，保障人民群眾用藥安全，本研究建立了高效液相色譜法測定注射用單磷酸阿糖腺苷中的主要雜質阿糖腺苷和腺嘌呤的含量，該法檢測結果準確、操作簡單、靈敏度高，現報告如下。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀、Waters 2998型二極管陣列檢測器(美國沃特世公司);梅特勒XS64電子天平(萬分之一，美國梅特勒-托利多公司);PRO-R雙級反滲透超純水機(上海礫鼎水處理設備有限公)。

1.2 藥品與試劑

甲醇為色譜純(德國默克公司)，實驗用水為自制超純水，磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉為分析純(國藥集團);單磷酸阿糖腺苷(中國食品藥品檢定研究院，批號:140710-201002)，阿糖腺苷(上海萬疆生物技術有限公司，批號:Z0119)，腺嘌呤(購自中國食品藥品檢定研究院，批號:110886-201102)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:依利特 Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);柱溫:30 ℃;流動相:甲醇-磷酸鹽緩沖液(V∶V=20∶80，磷酸氫二鈉26.9 g+磷酸二氫鈉29.3 g溶于超純水，并定容至1000 ml);流速:1 ml/min;進樣量:10 μl;檢測波長:260 nm。

2.2 系統(tǒng)適應性試驗

按“2.1”項下色譜條件進行試驗，單磷酸阿糖腺苷、阿糖腺苷、腺嘌呤均能很好地分離，保留時間分別為5.6、13.3和22.1 min，理論塔板數分別為8754、6570和8855，分離度均 ＞3，見圖1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備:分別精密稱取單磷酸阿糖腺苷、阿糖腺苷、腺嘌呤49.8、50.3、50.5 mg，分別置于10 ml容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液流動相稀釋并定容至10 ml，得到對照品溶液;分別精密量取對照品溶液1 ml，分別置于10 ml容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液流動相稀釋并定容至10 ml，得到對照品使用液，質量濃度分別為 498、503、505 μg/ml。

2.3.2 供試品溶液的制備:精密稱取注射用單磷酸阿糖腺苷0.5117 g，置于10 ml容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液流動相稀釋并定容至10 ml，樣品溶液質量濃度為51.17 mg/ml;精密量取1 ml樣品溶液，置于100 ml容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液流動相稀釋并定容至100 ml，得供試品溶液，質量濃度為511.7 μg/ml。

2.4 專屬性試驗

2.4.1 酸破壞試驗:取供試品溶液2 ml，置于25 ml容量瓶中，加入0.5 mol/L鹽酸溶液5 ml，置于40℃恒溫水浴鍋中30 min，放冷至室溫(25℃)，用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至中性，然后用磷酸鹽緩沖液流動相稀釋并定容至25 ml，搖勻，按“2.1”項下色譜條件操作。

圖1 主峰與已知雜質峰色譜圖Fig 1 The chromatograms of main peak and impurity peaks

2.4.2 堿破壞試驗:取供試品溶液2 ml，置于25 ml容量瓶中，加入0.5 mol/L氫氧化鈉溶液5 ml，置于40℃恒溫水浴鍋30 min，放冷至室溫，用0.5 mol/L鹽酸溶液調節(jié)pH值至中性，然后用磷酸鹽緩沖液流動相稀釋并定容至25 ml，搖勻，按“2.1”項下色譜條件操作。

2.4.3 加熱破壞試驗:稱取注射用單磷酸阿糖腺苷約5 g，置于105℃烘箱中2 h;精密稱取經烘烤的樣品10.3 mg，置于25 ml容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液流動相稀釋并定容至25 ml，搖勻，按“2.1”項下色譜條件操作。

2.4.4 光照試驗:稱取注射用單磷酸阿糖腺苷約5 g，鋪平后置于照度為4500 Lx下照射24 h;精密稱取經照射的樣品10.5 mg，置于25 ml容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液流動相稀釋并定容至25 ml，搖勻，按“2.1”項下色譜條件操作。

2.4.5 氧化破壞試驗:取供試品溶液2 ml，置于25 ml容量瓶中，加入30%過氧化氫溶液1 ml，然后用磷酸鹽緩沖液流動相稀釋并定容至25 ml，搖勻，按“2.1”項下色譜條件操作。

專屬性試驗結果顯示，注射用單磷酸阿糖腺苷對酸破壞試驗和光照試驗不敏感，對堿破壞試驗、加熱破壞試驗和氧化破壞試驗高度敏感，見圖2。

圖2 專屬性試驗色譜圖Fig 2 Chromatogram of specificity test

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察:精密量取對照品使用液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、4.0 ml，分別置于 100 ml容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液流動相稀釋并定容至100 ml，搖勻，按“2.1”項下色譜條件操作。以峰面積A為縱坐標，質量濃度C為橫坐標，繪制標準曲線，計算得回歸方程:A阿糖腺苷=384.511 C+12.735，R2=0.9998，線性范圍為 0.503 ～ 20.120 μg/ml;A腺嘌呤=563.847 C+15.674，R2=0.9999，線性范圍為0.505 ～20.200 μg/ml。

2.5.2 檢出限和定量限:以信噪比(S/N)=3∶1為檢出限，S/N=10∶1為定量限，逐步吸收供試品溶液，計算得阿糖腺苷、腺嘌呤的檢出限分別為0.89、1.04 ng，定量限分別為3.01、3.45 ng。

2.5.3 重復性試驗:取樣品批號為20140511的樣品按“2.1”項下色譜條件操作，平行試驗6份，測定樣品中阿糖腺苷和腺嘌呤的含量，結果分別為0.19%(RSD=0.22%)、0.21%(RSD=0.19%)。

2.5.4 回收率試驗:分別取“2.3.2”項下樣品溶液1 ml置于9個50 ml容量瓶中，分別取“2.3.1”項下對照品溶液0.8、0.8、0.8、1.0、1.0、1.0、1.2、1.2 和 1.2 ml，照“2.1”項下色譜條件操作，測定試樣中阿糖腺苷和腺嘌呤的含量，結果分別為99.8%(RSD=0.21%)、100.1%(RSD=0.20%)。

2.6 有關物質的測定

按“2.1”項下色譜條件測定3批注射用單磷酸阿糖腺苷中有關物質的含量，結果見表1。

表1 注射用單磷酸阿糖腺苷中有關物質含量的測定結果(%)Tab 1 Determination result of related substances in vidarabine monophosphate(%)

3 討論

有關物質主要是指在生產過程中帶入的起始原料、中間體、聚合體、副反應產物，以及貯藏過程中的降解產物等［5-9］。有關物質的研究是藥品質量研究中關鍵性的項目之一，其含量是反映藥品純度的直接指標。藥品在臨床使用中產生的不良反應除了與藥品本身的藥理活性有關外，有時與藥品中存在的雜質也有很大關系［10-13］。單磷酸阿糖腺苷是以阿糖腺苷、腺嘌呤和磷酸為原料合成的藥物，首先，阿糖腺苷和腺嘌呤在酶的作用下，生成阿糖腺苷中間產物，經提取、濃縮、精制得到高純度的阿糖腺苷;然后，阿糖腺苷經磷酸化得到單磷酸阿糖腺苷。由其生成工藝過程可見，阿糖腺苷和腺嘌呤在精制過程中難以除盡;另外，單磷酸阿糖腺苷在儲藏中受溫度、濕度等外界環(huán)境條件的影響，可分解產生阿糖腺苷和腺嘌呤，成為主要雜質成分，對藥物的療效和安全性構成潛在的風險［14-16］。目前，注射用單磷酸阿糖腺苷的國家標準未對其有關物質進行相關的規(guī)定。

本研究結合單磷酸阿糖腺苷、阿糖腺苷和腺嘌呤的紫外光譜圖，確定3種化合物在260 nm波長處有較大吸收，因此，選擇260 nm為檢測波長。預實驗結果表明，采用依利特Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5μm)、柱溫為30℃、流動相為甲醇-磷酸鹽緩沖液時，樣品中各色譜峰分離度好，峰對稱性好，因此，本研究采用以上色譜條件。本研究結果表明，注射用單磷酸阿糖腺苷對堿、高溫和氧化敏感，主要功效成分會顯著降低或完全被破壞。

綜上所述，本法用于測定注射用單磷酸阿糖腺苷的有關物質，分離度高、理論塔板數高、峰對稱性好、檢出限低、重現性高，已知雜質成分線性方程相關系數高，可用于實踐檢測、控制注射用單磷酸阿糖腺苷的質量，保障其臨床療效，同時提高用藥安全性。

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