汪順才 毛 玲 梁 靚 左 念 祝 寅江蘇省句容市人民醫(yī)院血液腫瘤科，江蘇句容 212400

苦參堿聯(lián)合卡鉑對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖及凋亡的影響

汪順才 毛 玲 梁 靚 左 念 祝 寅
江蘇省句容市人民醫(yī)院血液腫瘤科，江蘇句容 212400

[摘要]目的 探討苦參堿聯(lián)合卡鉑對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制。 方法 將體外培養(yǎng)人SGC-7901細(xì)胞分為對(duì)照組、苦參堿組（1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL）、卡鉑組（0.01mg/mL）及苦參堿聯(lián)合卡鉑組。MTT檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制率，F(xiàn)CM檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞的CXCR4 mRNA表達(dá)。 結(jié)果 相同濃度苦參堿聯(lián)合卡鉑組增殖抑制率及凋亡率明顯高于單藥苦參堿組（P＜0.05）及其單藥卡鉑組（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組CXCR4mRNA灰度值均降低（P＜0.05）。相同濃度苦參堿聯(lián)合卡鉑組灰度值明顯低于單藥苦參堿組（P＜0.05）及其單藥卡鉑組（P＜0.05）。 結(jié)論 苦參堿聯(lián)合卡鉑能發(fā)揮正協(xié)同作用人胃癌SGC-7901細(xì)胞，劑量依賴性的抑制其增殖并誘導(dǎo)凋亡，該作用可能與抑制細(xì)胞內(nèi)CXCR4 mRNA 表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]人胃癌SGC-7901細(xì)胞；苦參堿；卡鉑；趨化因子受體4

胃癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，早期患者大多無(wú)明顯臨床癥狀，通常發(fā)現(xiàn)時(shí)，都處于晚期[1]。化療是目前治療胃癌的主要手段。卡鉑（carboplatin）為第二代鉑類化療藥物，屬于細(xì)胞周期非特異性抗腫瘤藥物，廣泛用于包括胃癌在內(nèi)的實(shí)體瘤的治療。然而，臨床在追求療效的同時(shí)，毒副作用也很明顯[2]。中藥苦參堿抗腫瘤作用近年受到學(xué)者廣泛關(guān)注[3-6]，本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度苦參堿聯(lián)合卡鉑作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞，觀察苦參堿與卡鉑是否有協(xié)同抗人胃癌SGC-7901細(xì)胞的作用及其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

人胃癌SGC-7901細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；苦參堿（粉末，純度≥98%）購(gòu)自中鑫科技生物有限公司；卡鉑注射液（規(guī)格10Ml:100mg，齊魯制藥有限公司，H20020180）購(gòu)自句容市人民醫(yī)院；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Annexin-V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京寶賽公司；CXCR4mRNA、β-actin由艾博思生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)及合成；自動(dòng)酶聯(lián)檢測(cè)儀；流式細(xì)胞儀；電泳儀等。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)

SGC-7901細(xì)胞(細(xì)胞代數(shù)：P2）在RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素）中培養(yǎng)傳代，5～7d傳代1次。孵育箱培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2，100%濕度。保持細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期。

2.2分組

（1）（陰性）對(duì)照組：僅人SGC-7901細(xì)胞不經(jīng)任何處理。（2）苦參堿1.0mg/mL組；（3）苦參堿2.0mg/mL組；（4）苦參堿3.0mg/mL組；（5）卡鉑0.01mg/mL組；（6）苦參堿1.0mg/mL聯(lián)合卡鉑組；（7）苦參堿2.0mg/mL聯(lián)合卡鉑組；（8）苦參堿3.0mg/mL聯(lián)合卡鉑組。

2.3SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期1×104/mL的SGC-7901細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，按實(shí)驗(yàn)分組加藥，作用24h。各組同時(shí)進(jìn)行MTT分析，設(shè)陰性對(duì)照組，每組6個(gè)復(fù)孔，每孔加MTT（5mg/mL）20μL，孵育4h后吸去孔內(nèi)上清液，每孔加150μL DMSO，震蕩15min，1h內(nèi)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔492 nm波長(zhǎng)的吸光度( OD 值)。增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度)×100%。

2.4SGC-7901細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔接種于六孔板中，按上述實(shí)驗(yàn)分組加藥，作用24h。各組同時(shí)進(jìn)行FCM檢測(cè)。4℃預(yù)冷的PBS洗滌2次，1000rpm/min離心10min(離心半徑 15cm)，重懸于200μL Binding Buffer中；加入10μL Annexin V-FITC后，室溫避光15min，再加300μL Binding Buffer 及5μL PI 充分混勻，于1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

2.5SGC-7901細(xì)胞CXCR4 mRNA表達(dá)檢測(cè)

將細(xì)胞制成1×104/mL細(xì)胞懸液接種于50mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。每組設(shè)3個(gè)樣本。提取總RNA(Trizol Reagent法)，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度及完整性，以O(shè)D260/OD280在1.8～2.0之間為純凈RNA的標(biāo)準(zhǔn)。按說(shuō)明書(shū)步驟逆轉(zhuǎn)錄mRNA為cDNA。PCR擴(kuò)增：（1）CXCR4引物：產(chǎn)物大小為127bp。上游序列5’-CTGCCCTCCTGCTGACTATTCC-3’；下游序列5’-ATGATGTGCTGAAACTGGAACAC-3’。β-actin引物：產(chǎn)物大小為130bp。上游序列5’-CGAAACTACCTTCAACTCCATC-3’；下游序列為5’-AGTGATCTCCTTCTGCATCCT-3’。（2）引物及內(nèi)參照擴(kuò)增：反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，56℃(CXCR4) /56℃(β-actin)退火30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。利用電腦成像分析系統(tǒng)檢測(cè)PCR產(chǎn)物與β-actin的積分光密度比值，半定量分析目的基因的表達(dá)。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1MTT檢測(cè)苦參堿聯(lián)合卡鉑對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率的影響

隨著單藥苦參堿濃度（1.0～3.0mg/mL）的增高，抑制率逐漸增高（F=120.88，P＜0.05）?？鄥A（1.0～3.0mg/mL）聯(lián)合卡鉑組（0.01mg/mL）抑制率明顯高于單藥苦參堿組及單藥卡鉑組，具有濃度依賴性（P＜0.05）。表明苦參堿聯(lián)合卡鉑能發(fā)揮正協(xié)同作用抑制細(xì)胞增殖。見(jiàn)表1。

表1　各組細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率（±s，%）

表1　各組細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率（±s，%）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與苦參堿1.0mg/mL組比較，bP＜0.05；與苦參堿2.0mg/mL組比較，cP＜0.05；d與苦參堿3.0mg/mL組比較，dP＜0.05；與卡鉑組比較，eP＜0.05；與苦參堿1.0mg/mL+卡鉑組比較，fP＜0.05g；與苦參堿2.0mg/mL+卡鉑組比較，gP＜0.05。

?

3.2 FCM檢測(cè)苦參堿聯(lián)合卡鉑對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡率的影響

各單藥苦參堿組(1.0～3.0mg/mL)凋亡率均高于對(duì)照組，且隨著苦參堿濃度的增高，凋亡率逐漸增高（F=52.05，P＜0.05）?？鄥A(1.0～3.0mg/mL)聯(lián)合卡鉑組（0.01mg/mL）凋亡率明顯高于單藥苦參堿組及單藥卡鉑組，具有濃度依賴性（P＜0.05）。表明苦參堿聯(lián)合卡鉑能發(fā)揮正協(xié)同作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。見(jiàn)表1。

3.3RT-PCR檢測(cè)CXCR4 mRNA的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中灰度值比值為（0.86±0.03）高于（1.0～3.0mg/mL）苦參堿單藥組（P＜0.01）。隨苦參堿藥物濃度增加，灰度值比值逐漸降低（分別為0.71±0.02、0.63±0.01、0.56±0.03，F(xiàn)=108.44，P＜0.01）?？鄥A（1.0～3.0mg/mL）聯(lián)合卡鉑組（0.01mg/mL）灰度值比值分別為（0.52±0.02、0.45±0.03、0.26±0.03）明顯低于單藥苦參堿組及單藥卡鉑組（0.61±0.07），具有濃度依賴性（P＜0.05）。表明苦參堿聯(lián)合卡鉑能發(fā)揮正協(xié)同作用抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡可通過(guò)降低CXCR4 mRNA 表達(dá)實(shí)現(xiàn)。見(jiàn)圖1。

圖1　細(xì)胞表達(dá)電泳圖M：Marker；A：對(duì)照組 B：苦參堿1.0mg/mL組 C：苦參堿2.0mg/mL組 D：苦參堿3.0mg/mL組 E：卡鉑 0.01mg/mL 組 F：苦參堿1.0mg/mL 聯(lián)合卡鉑組 G：苦參堿2.0mg/mL聯(lián)合卡鉑組 H：苦參堿3.0mg/mL 聯(lián)合卡鉑組

4 討論

苦參堿（matrine）是從豆科植物中提取的活性成分。研究表明，苦參堿在抗腫瘤、抗炎、抗纖維化、抗病毒、保肝、抗過(guò)敏、抗心律失常等方面具有廣泛的藥理活性[7-11]?；熾m是胃癌的主要治療手段，相比單藥化療，聯(lián)合中藥方案能有效減輕傳統(tǒng)化療藥物的副作用，并能提高療效。研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿聯(lián)合順鉑能抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，且能提高順鉑化療的敏感性[12]?？鄥A聯(lián)合阿霉素呈時(shí)間及劑量依賴性抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡，且證實(shí)苦參堿可作為抗癌藥的化療增敏劑[13]。目前苦參堿聯(lián)合卡鉑是否能發(fā)揮正協(xié)同作用人胃癌SGC-7901細(xì)胞，尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT及FCM檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)苦參堿在1.0～3.0mg/mL濃度范圍內(nèi)能抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，呈劑量依賴性。隨著苦參堿濃度的增高，抑制率及凋亡率逐漸增高。臨床上，卡鉑單藥應(yīng)用對(duì)人體造成相當(dāng)大的毒副作用，如消化道反應(yīng)：惡心、嘔吐；骨髓抑制：中性粒細(xì)胞、血紅蛋白及血小板計(jì)數(shù)下降；耳毒性：腎、膀胱、輸尿管毒性：急性腎功能衰竭。從臨床長(zhǎng)期應(yīng)用看，單藥化療效果不甚理想。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同濃度（1.0～3.0mg/mL）苦參堿聯(lián)合卡鉑（0.01mg/mL）作用人胃癌SGC-7901細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組的抑制率及凋亡率明顯高于單藥苦參堿組及單藥卡鉑組，具有濃度依賴性。表明苦參堿聯(lián)合卡鉑能發(fā)揮正協(xié)同作用抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡。

胃癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)生及發(fā)展關(guān)系到癌基因的激活及抑癌基因的失活等。因此，檢測(cè)胃癌相關(guān)基因的表達(dá)有助于胃癌的診斷、治療及預(yù)后[14]。趨化因子（chemokines)通過(guò)作用于趨化因子受體參與白細(xì)胞浸潤(rùn)至腫瘤，刺激腫瘤細(xì)胞增殖及調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)血管生成。趨化因子受體4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4) 為含有7個(gè)跨膜區(qū)的G蛋白耦聯(lián)受體的超家族，由352個(gè)氨基酸組成[15-16]，在腫瘤細(xì)胞（如胃癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌）中普遍表達(dá)，且在腫瘤的增殖、侵襲、浸潤(rùn)、播散、轉(zhuǎn)移及免疫抑制等方面發(fā)揮重要作用[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)CXCR4在胃癌組織中高表達(dá)，且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織表達(dá)更顯著，可作為判斷胃癌患者病程及預(yù)后的重要指標(biāo)[19]。在胃癌的發(fā)生發(fā)展中，下調(diào)CXCR4mRNA表達(dá)可能成為治療胃癌的新的靶點(diǎn)。

通過(guò)RT-PCR檢測(cè)CXCR4mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)一定濃度范圍內(nèi)（1.0～3.0mg/mL）苦參堿組CXCR4mRNA表達(dá)低于對(duì)照組，具有劑量依賴性?？鄥A（1.0～3.0mg/mL）聯(lián)合卡鉑組（0.01mg/mL）CXCR4 mRNA表達(dá)明顯低于單藥苦參堿組及單藥卡鉑組，具有濃度依賴性。表明苦參堿聯(lián)合卡鉑能發(fā)揮正協(xié)同作用抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡可通過(guò)降低CXCR4 mRNA 表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)條件下，一定濃度范圍內(nèi)苦參堿聯(lián)合卡鉑能發(fā)揮正協(xié)同作用人胃癌SGC-7901細(xì)胞，劑量依賴性的抑制其增殖并誘導(dǎo)凋亡，該作用可能與下調(diào)細(xì)胞內(nèi)CXCR4 mRNA 表達(dá)有關(guān)。為目前尚無(wú)有效藥物治愈胃癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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[中圖分類號(hào)]R329.26

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]2095-0616（2015）23-35-04

[基金項(xiàng)目]江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)臨床科技發(fā)展基金項(xiàng)目（JLY20140074）

收稿日期：（2015-10-05）

Effects of matrine and carboplatin of proliferation and apoptosis in human gastric carcinoma SGC-7901 cells

WANG Shuncai MAO Ling LIANG Liang ZUO Nian ZHU Yin
Department of Hematology Oncology,Jurong People's Hospital,Jurong 212400,China

[Abstract]Objective To investigate the effects of matrine and carboplatin on the CXCR4 expression of proliferation and apoptosis in human gastric carcinoma SGC-7901 in vitro,and its potential mechanism. Methods SGC-7901 cells were treated with matrine(final concentrations=1.0,2.0 and 3.0mg/mL) and carboplatin(final concentrations=0.01mg/ mL),either each alone or in combination.The viability in treated SGC-7901 cells was assessed by MTT.Cell apoptosis of SGC-7901 was assessed by flow cytometry.CXCR4 mRNA abundance by RT-PCR. Results Matrine and carboplatin,either each alone or in combination,significantly increased inhibition rate (P＜0.05),significantly higher apoptotic rate(P＜0.05),and decreased CXCR4mRNA abundance(P＜0.05).The above effects of SGC-7901 cells were more pronounced when they were jointed in combination than they were used alone(P＜0.05). Conclusion Matrine and carboplatin in combination can signifcantly inhibit the proliferation and induce apoptosis of SGC-7901 cells in a dose-dependent manner,the observed effects of matrine may be related to decreased CXCR4 expression.

[Key words]SGC-7901;Matrine;Carboplatin;Chemokine receptor 4