肖連冬，程 爽

（南陽理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，南陽 473000）

膳食纖維被譽(yù)為“第七營養(yǎng)素”[1]，按溶解性不同可分為可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）兩類，二者在人體內(nèi)所具有的生理結(jié)構(gòu)和保健作用不同，SDF在許多方面比IDF有更強(qiáng)的生理功能，如防治便秘、降低膽固醇等[2]。啤酒糟又叫麥糟，是一個寶貴的膳食纖維資源，但較低的SDF含量是其生理活性較低的原因所在，高品質(zhì)膳食纖維的可溶性成分含量應(yīng)該達(dá)到10%以上[3]。藥食用真菌具有降解、轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞壁纖維組分的酶系統(tǒng)[4]，通過發(fā)酵，消耗原料中的碳源、氮源，以消除原料中的淀粉、蛋白質(zhì)等成分，并通過對木質(zhì)素、纖維素等不溶性膳食纖維的分解，使IDF轉(zhuǎn)化為SDF，提高SDF的含量，同時(shí)生成菌體多糖、菌體纖維素，提高膳食纖維的生理活性和實(shí)用價(jià)值[5-6]。本研究以啤酒糟為原料，以平菇菌為膳食纖維生產(chǎn)的發(fā)酵菌株，采用液態(tài)發(fā)酵方式，通過研究輔料麩皮、豆渣、玉米粉的添加及配比對發(fā)酵制取膳食纖維品質(zhì)的影響，優(yōu)化出最佳培養(yǎng)基配方，提高其SDF含量，獲得高品質(zhì)的膳食纖維，為平菇液態(tài)發(fā)酵制取優(yōu)質(zhì)啤酒糟膳食纖維提供了一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌種

平菇-650（Pleurotus ostreatus-650）：南陽理工學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試驗(yàn)原料

啤酒糟（含水量8.74%）：南陽天冠啤酒有限公司；玉米粉（含水量15.11%）、麩皮（含水量4.09%）、豆渣（含水量19.78%）：市售。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌種活化及平板培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖（potatodextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g。將馬鈴薯去皮，切塊，煮沸30 min，紗布過濾，再加糖及瓊脂，溶化后補(bǔ)足水至1 000 mL。

種子培養(yǎng)基：玉米粉20g/L，酵母膏3g/L，KH2PO41.5g/L，蔗糖10 g/L，MgSO40.5 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：啤酒糟、麩皮、玉米粉、豆渣按一定比例配制。

1.2 儀器與設(shè)備

101A-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海申光儀器儀表有限公司；HZQ-B型恒溫?cái)?shù)顯搖床：蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司；SHB-3型循環(huán)水多用真空泵：上海精科儀器有限公司；PYXPHS-50型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-2G型雙人凈化工作臺：蘇州凈化；LDZX-40Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；FW-100型粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；TDL-40B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器總廠；FA10004型電子天平：上海天平儀器廠；SHA-C恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；JA1003分析天平：上海良平儀器儀表有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試管母種的活化及平板培養(yǎng)

菌種活化在試管中進(jìn)行，用滅菌的接種鏟從原保藏斜面鏟下菌塊2塊，接種到滅菌的試管斜面培養(yǎng)基上，在25℃恒溫培養(yǎng)6～7 d，直到長滿試管，再進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)接活化，第二次活化培養(yǎng)時(shí)間約需4～5 d，根據(jù)菌種保藏時(shí)間的長短，一般需活化2～3次。然后將試管菌種轉(zhuǎn)接在平板上，便于在接種種子液時(shí)，用打孔器準(zhǔn)確取菌塊用。平板在25℃恒溫培養(yǎng)直至長滿固體平面，挑選菌絲潔白、粗壯、濃密、無污染的菌種作為下一步的供試菌種。

1.3.2 測定生長曲線

取8個250 mL三角瓶，分別加入100 mL種子培養(yǎng)基，滅菌，冷卻。用打孔器取生長良好的平板菌種，每個三角瓶接種4塊，置于25℃轉(zhuǎn)速120r/min的恒溫振蕩器上培養(yǎng)0～7d，每天取對應(yīng)時(shí)間編號的三角瓶，離心（3 500 r/min，15 min）后測定平菇-650菌絲濕質(zhì)量。以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌絲濕質(zhì)量為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.3.3 種子液的制備

在無菌條件下，用打孔器在長滿菌絲體的培養(yǎng)基平板上取菌種塊4塊，接入裝有100 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，內(nèi)裝4顆玻璃珠避免菌絲成塊，在轉(zhuǎn)速120 r/min，25℃恒溫振蕩培養(yǎng)3.5 d，得到種子液，發(fā)酵備用。

1.3.4 啤酒糟膳食纖維發(fā)酵試驗(yàn)

將啤酒糟、麩皮、豆渣和玉米粉分別干燥，粉碎過40目篩后按一定比例混合，以料液比1∶10（g∶mL）加水，用250 mL三角瓶裝100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，每瓶放入4枚潔凈的玻璃珠，滅菌后接入10%搖瓶種子液，置于恒溫振蕩器中發(fā)酵（25℃，120 r/min，5 d），干燥即得活性膳食纖維產(chǎn)品。

1.3.5 可溶性膳食纖維含量測定[7-11]

取膳食纖維樣品1.00 g，沸水浴糊化，加入淀粉酶、糖化酶，40℃酶解3 h后，冷卻離心（3 500 r/min，15 min），加入4倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇沉淀約8h，離心得SDF沉淀，用無水乙醇洗滌離心2次，再加丙酮洗滌離心1次，真空干燥至質(zhì)量恒定即為SDF。SDF得率計(jì)算公式如下：

1.3.6 單因素試驗(yàn)

以SDF得率為考察指標(biāo)，在由啤酒糟、麩皮、豆渣和玉米粉組成的培養(yǎng)基中，分別通過改變麩皮、玉米粉和豆渣添加量，考察其對可溶性膳食纖維得率的影響，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.7 膳食纖維發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化方案設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，綜合考察麩皮含量、玉米粉含量和豆渣含量對啤酒糟膳食纖維SDF得率的綜合影響。分析因素的主次順序及影響顯著性，優(yōu)化培養(yǎng)基組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 平菇-650生長曲線繪制

平菇-650生長曲線見圖1。從圖1可見，在該培養(yǎng)液中，平菇-650的生長顯示了較為明顯的4個時(shí)期，分別為遲緩期（0～1 d）、對數(shù)生長期（1～4 d）、穩(wěn)定期（4～5 d）和衰亡期（5 d后）。微生物的移種時(shí)間一般選擇對數(shù)期的中后期，此時(shí)菌種不僅活力強(qiáng)，且密度較大，綜合考慮，種齡選取3.5 d較為合適。

圖1 平菇-650生長曲線Fig.1 Growth curve ofPleurotus ostreatus-650

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 玉米粉添加量對可溶性膳食纖維得率的影響

圖2 玉米粉含量對可溶性膳食纖維得率的影響Fig.2 Effect of corn flour content on soluble dietary fiber yield

在啤酒糟發(fā)酵培養(yǎng)基混合料中，麩皮和豆渣含量均定為3%，玉米粉含量分別選取0、2%、3%、4%、5%、6%，考察其對SDF得率的影響，發(fā)酵結(jié)果見圖2。

玉米粉可以為菌種提供碳源、氮源及生長因子，添加一定量的玉米粉有利于菌種的生長代謝[12]。由圖2可知，玉米粉添加量對發(fā)酵生產(chǎn)膳食纖維的品質(zhì)影響較大。當(dāng)玉米粉加量為2%時(shí)，SDF得率最高達(dá)15.14%，隨玉米粉含量的繼續(xù)增大SDF得率逐漸下降?；|(zhì)中的碳氮比對真菌生長有一定的影響，在碳源相對充足的前提下，隨著基質(zhì)中氮元素量的增加，菌體產(chǎn)量會隨之增加，但增加到一定程度后，產(chǎn)量增速下降，超過一定量后，產(chǎn)量增速極緩慢甚至呈現(xiàn)負(fù)增長。適當(dāng)添加玉米粉能促進(jìn)菌體的大量生長，對菌種產(chǎn)纖維素酶有利，生成更多的SDF，但玉米粉加量過高，會造成液體培養(yǎng)基粘度增加，碳氮比過大，不利于菌體的生長。故單因素試驗(yàn)選擇玉米粉添加量為2%。

2.2.2 麩皮含量對可溶性膳食纖維得率的影響

啤酒糟培養(yǎng)基中添加麩皮，使麩皮含量分別為0、1%、2%、3%、4%、5%、6%，玉米粉和豆渣含量均為3%，考察其對SDF得率的影響，發(fā)酵結(jié)果見圖3。

圖3 麩皮含量對可溶性膳食纖維得率的影響Fig.3 Effect of wheat bran content on soluble dietary fiber yield

麩皮是食用真菌生長的很好氮源和生長因子，能明顯促進(jìn)菌種的繁殖和代謝。由圖3可知，麩皮加量對發(fā)酵生產(chǎn)麥糟膳食纖維影響很大，在4%以下時(shí)，隨著麩皮加量增加，SDF快速增加。在麩皮含量4%時(shí)，SDF得率達(dá)到最高15.3%，可能是因?yàn)辂熎ご龠M(jìn)了微生物的代謝和生物量的積累，而菌體內(nèi)自身合成的微生物多糖也有助于SDF的提高[5，13]。繼續(xù)增加麩皮量，SDF得率略降。故選擇麩皮添加量為4%。

2.2.3 豆渣含量對可溶性膳食纖維得率的影響

在啤酒糟培養(yǎng)基中，玉米粉和麩皮含量均為3%，豆渣含量分別取0、1%、2%、3%、4%、5%、6%，考察其對SDF得率的影響，發(fā)酵結(jié)果見圖4。

由圖4可知，豆渣對發(fā)酵生產(chǎn)啤酒糟膳食纖維有影響，膳食纖維中SDF得率隨培養(yǎng)基中豆渣含量的增加而呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，3%豆渣含量時(shí)更有利于SDF的生成，SDF得率達(dá)到最大。豆渣含有大量的氨基酸、礦物質(zhì)和維生素，添加適量有利于菌體的生長代謝[14-15]，但過多也不利于SDF和IDF的積累。

圖4 豆渣含量對可溶性膳食纖維得率的影響Fig.4 Effect of soybean dreg content on soluble dietary fiber yield

2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化啤酒糟膳食纖維發(fā)酵培養(yǎng)基配方，綜合考察麩皮含量、玉米粉含量和豆渣含量對麥糟膳食纖維SDF得率影響。試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見表1，方差分析結(jié)果見表2。

表1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for medium components optimization

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiment results

從表1極差分析結(jié)果可見，對SDF得率影響因素的主次順序?yàn)锽＞A＞C，最優(yōu)組合為A2B1C2，即玉米粉2%，豆渣2%，麩皮4%。對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，在選取的因素水平內(nèi)，豆渣和玉米粉兩因素對SDF得率影響均達(dá)到極顯著水平，麩皮對SDF得率影響達(dá)顯著水平，這與極差分析的結(jié)果一致。A2B1C2為正交表中所涵蓋的試驗(yàn)，其SDF得率為15.64%。為驗(yàn)證結(jié)果可靠性，在最優(yōu)組合條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)進(jìn)行3組，每組平行3個，取其平均值，SDF得率為15.71%，達(dá)到了正交試驗(yàn)的最優(yōu)結(jié)果。

3 結(jié)論

采用平菇-650發(fā)酵啤酒糟生產(chǎn)高活性膳食纖維過程中，添加玉米粉、豆渣和麩皮可提高SDF的含量，使膳食纖維質(zhì)量得以提高。試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳培養(yǎng)基輔料添加組合為玉米粉2%，豆渣2%，麩皮4%。因此發(fā)酵培養(yǎng)基整體配方為啤酒糟92%、玉米粉2%、豆渣2%、麩皮4%，在該培養(yǎng)基組合條件下進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)膳食纖維，SDF得率可達(dá)到15.71%。試驗(yàn)結(jié)果為平菇液態(tài)發(fā)酵啤酒糟制取優(yōu)質(zhì)膳食纖維提供了一定參考。

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