車佳

水飛薊賓通過降低MEK/ERK途徑依賴的MMP-9蛋白表達抑制人乳腺癌細胞生長和侵襲轉(zhuǎn)移機制的實驗研究

車佳

目的 探討水飛薊賓對人乳腺癌細胞生長和侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機制。方法 用不同濃度水飛薊賓處理人乳腺癌細胞系MCF-7 24h，采用MTT（噻唑藍）法和臺盼藍染色法檢測水飛薊賓對MCF-7細胞的抑制作用；采用transwell技術(shù)檢測水飛薊賓對MCF-7細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響；Western blot檢測水飛薊賓對MCF-7細胞MEK及ERK（均為絲裂原激活的蛋白激酶）蛋白磷酸化水平及基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達水平的影響。結(jié)果 水飛薊賓可顯著抑制MCF-7細胞的增殖并造成腫瘤細胞死亡，與對照組比較，水飛薊賓增殖抑制率［20μM（8.9±3.8）%、50μM（19.7±4.2）%、100μM（29.8±5.7）%比0］、臺盼藍染色率［50μM（16.1±4.8）%、100μM（25.3±5.1）%比（3.4±1.4）%］，均升高（P＜0.05，P＜0.01）；水飛薊賓通過抑制MEK（水飛薊賓20μM：0.26±0.03、50μM：0.15±0.03、100μM：0.11±0.02比對照組：0.35±0.04）和ERK（水飛薊賓20μM：0.23±0.03、50μM：0.12±0.02、100μM：0.07±0.01比對照組：0.32±0.05）的磷酸化降低MMP-9（水飛薊賓50μM：0.18±0.03、100μM：0.14±0.02比對照組：0.29±0.04）的表達并抑制MCF-7［水飛薊賓20μM：（14.3±2.1）%、50μM：（35.6± 5.7）%、100μM（53.1±6.5）%比對照組：0］細胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 水飛薊賓抑制人乳腺癌細胞的生長和侵襲轉(zhuǎn)移。

乳腺癌；水飛薊賓；MEK/ERK；MMP-9；腫瘤侵襲

水飛薊賓是水飛薊素中最主要的生物活性成分，來源于水飛薊屬植物奶薊種子的提取物，臨床上主要用于保護肝細胞，對肝炎、膽囊疾病有良好的療效，具有高效、低毒、低副作用的特性[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓有抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用[2]，研究人員還發(fā)現(xiàn)水飛薊賓治療能推遲Her2/neu（一種原癌基因）轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)性乳腺癌的發(fā)生并減小腫瘤的體積和質(zhì)量[3]。乳腺癌的發(fā)生率和死亡率僅次于肺癌，而在女性群體中是發(fā)生率最高的惡性腫瘤，它的高轉(zhuǎn)移性使之目前仍無法治愈[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是一種明膠酶，能降解腫瘤附近組織基底膜的Ⅳ型膠原，從而促進腫瘤細胞向正常組織的侵襲和轉(zhuǎn)移[5]，乳腺癌患者血清MMP-9水平如果顯著升高往往預(yù)示著腫瘤的轉(zhuǎn)移和惡化[6]。本研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓能抑制乳腺癌細胞的生長，更重要的是，水飛薊賓還能通過抑制MMP-9的表達抑制乳腺腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌細胞系MCF-7來自于ATCC（American type culture collection，美國模式培養(yǎng)物研究所）。細胞培養(yǎng)在RPMI-1640（roswell park memorial institute-1640）培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，加入100U/L青霉素和100mg/mL鏈霉素，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫且通入5%的CO2。

1.2 實驗試劑 RPIM-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司；水飛薊賓、二甲亞砜、MTT、臺盼藍購自美國Sigma公司；β-actin、MMP-9、p-MEK（磷酸化MEK）、p-ERK（磷酸化ERK）抗體購自美國Cell signal公司；transwell小室購于美國康寧公司。

1.3 細胞增殖抑制試驗 將MCF-7細胞懸液用培養(yǎng)基調(diào)成5×104個/mL濃度，取200μL接種于96孔板，設(shè)置3個復(fù)孔，治療組分別加入10、20、50和100μM的水飛薊賓培養(yǎng)24h，對照組不加水飛薊賓培養(yǎng)24h，加5mg/mLMTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，往孔中加150μL二甲亞砜，在570nm波長下用酶標儀檢測OD（吸光度）值，腫瘤細胞生長抑制率=（對照組OD值-治療組OD值）/對照組OD值× 100%。

1.4 水飛薊賓對MCF-7細胞殺傷活性試驗 在MCF-7細胞培養(yǎng)體系中分別加入 10、20、50和100μM的水飛薊賓培養(yǎng)24h，對照組不加水飛薊賓培養(yǎng)24h，用臺盼藍染死細胞，低倍鏡下計數(shù)受染細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比值即為水飛薊賓對MCF-7細胞的殺傷率。

1.5 Western blot試驗 在MCF-7細胞培養(yǎng)體系中分別加入10、20、50和100μM的水飛薊賓培養(yǎng)2h，對照組不加水飛薊賓培養(yǎng)2h，之后將細胞裂解后做Western blot檢測磷酸化MEK和磷酸化ERK的含量，MMP-9蛋白表達水平需在上述培養(yǎng)體系中用水飛薊賓培養(yǎng)24h再用Western blot檢測，各蛋白表達量由它們在膠片上顯色后的灰度與相應(yīng)β-actin的灰度比表示。

1.6 腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移試驗 將MCF-7細胞懸液用無血清培養(yǎng)基調(diào)成2×104個/mL濃度，取500μL接種于transwell小室（即上室）中置于普通24孔板上，設(shè)置3個復(fù)孔，在上室中分別加入10、20、50和100μM的水飛薊賓培養(yǎng)24h，對照組不加水飛薊賓培養(yǎng)24h。普通24孔板（即下室）中培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI-1640。培養(yǎng)24h后取出transwell小室，用磷酸鹽緩沖液（PH7.4）洗去小室內(nèi)的細胞，將transwell膜用3%多聚甲醛固定15min后用0.1%結(jié)晶紫染色20min，低倍鏡（100×）觀察4個隨機選擇的區(qū)域，計算細胞總數(shù)，膜上細胞數(shù)越多表明腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移力越強。

1.7 統(tǒng)計學方法 所有實驗重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計分析軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，P值計算采用非配對雙邊t檢驗以及單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 水飛薊賓對MCF-7細胞的抑制作用 在水飛薊賓作用下實驗組相比于對照組均呈現(xiàn)劑量依賴性抑制效應(yīng)（P＜0.05），證實了水飛薊賓有體外抑制乳腺腫瘤細胞增殖的生物活性。臺盼藍染色試驗發(fā)現(xiàn)隨著水飛薊賓濃度的增加，MCF-7細胞染色率隨之增加，表明水飛薊賓有體外殺傷乳腺癌細胞的生物活性，見表1。

表1 水飛薊賓對MCF-7細胞的抑制作用（±s）

表1 水飛薊賓對MCF-7細胞的抑制作用（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

對照組10μM水飛薊賓組20μM水飛薊賓組50μM水飛薊賓組100μM水飛薊賓組33333 0 10 20 50 100 0 3.9±1.9 8.9±3.8* 19.7±4.2* 29.8±5.7** 3.5±1.4 5.2±2.6 9.4±3.1 16.1±4.8* 25.3±5.1**

2.2 水飛薊賓抑制MCF-7細胞的侵襲轉(zhuǎn)移 隨著水飛薊賓劑量的增加，transwell膜上的細胞數(shù)顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），且水飛薊賓對MCF-7的侵襲力的抑制率顯著高于同濃度下水飛薊賓對MCF-7的增殖抑制率（增殖抑制率為表1數(shù)據(jù)）（P＜0.05，P＜0.01）。證實水飛薊賓不僅能直接抑制乳腺腫瘤細胞的增殖，同時也能顯著抑制乳腺腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，見表2。

表2 水飛薊賓對乳腺癌細胞侵襲力的影響（±s）

表2 水飛薊賓對乳腺癌細胞侵襲力的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與同濃度水飛薊賓治療后的增殖抑制率比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別對照組10μM水飛薊賓組20μM水飛薊賓組50μM水飛薊賓組100μM水飛薊賓組孔數(shù)33333水飛薊賓濃度（μM）0 10 20 50 100細胞個數(shù)（個）305.4±33.8 288.6±46.7 261.5±38.3* 196.9±31.3** 143.6±18.1**侵襲抑制率（%）0 5.6±0.9 14.3±2.1* 35.6±5.7**△53.1±6.5**△△增殖抑制率（%）0 3.9±1.9 8.9±3.8* 19.7±4.2* 29.8±5.7**

表3 水飛薊賓對MCF-7細胞MEK及ERK蛋白磷酸化水平及MMP-9表達水平的影響（±s）

表3 水飛薊賓對MCF-7細胞MEK及ERK蛋白磷酸化水平及MMP-9表達水平的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶-9；p-MEK：磷酸化MEK；p-ERK：磷酸化ERK

組別對照組10μM水飛薊賓組20μM水飛薊賓組50μM水飛薊賓組100μM水飛薊賓組孔數(shù)33333水飛薊賓濃度（μM）0 10 20 50 100灰度比（MMP-9/β-actin）0.29±0.04 0.28±0.05 0.24±0.04 0.18±0.03* 0.14±0.02**灰度比（p-MEK/β-actin）0.35±0.04 0.30±0.04 0.26±0.03* 0.15±0.03* 0.11±0.02**灰度比（p-ERK/β-actin）0.32±0.05 0.29±0.05 0.23±0.03* 0.12±0.02** 0.07±0.01**

2.3 水飛薊賓對MCF-7細胞MEK及ERK蛋白磷酸化水平及MMP-9表達水平的影響 水飛薊賓能有效抑制MEK和ERK的磷酸化，從而使其下游的MMP-9蛋白表達受到抑制（P＜0.05，P＜0.01），減弱MCF-7細胞的侵襲力，見表3。

3 討論

乳腺癌的高度轉(zhuǎn)移性是乳腺癌難治及死亡率高的重要原因，腫瘤細胞在營養(yǎng)缺乏的環(huán)境下會向營養(yǎng)充足的組織侵襲遷移[7]。在這一過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）起著至關(guān)重要的作用，MMPs已經(jīng)被證實與腫瘤的分化、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)，而MMP-9是MMPs中的重要成員，有文獻報道，當MMP-9表達顯著增加時腫瘤的侵襲力增強，反之當MMP-9表達受抑制時腫瘤細胞的侵襲力減弱[8-9]。MMP-9基因的啟動子序列包含兩個轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，即AP-1（activator protein-1，激活子蛋白-1）和NF-κB[10]（nuclear factor-κB，核因子-κB）。這兩個轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的結(jié)合依賴于ERK蛋白激酶的激活，Raf/ MEK/ERK信號通路已經(jīng)被證實是AP-1和NF-κB活化的重要途徑[11-12]。本研究結(jié)果提示水飛薊賓可以通過阻斷這條信號通路抑制AP-1和NF-κB的活化從而抑制它們與MMP9基因啟動子的結(jié)合，這可能是水飛薊賓抑制乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要機制之一。水飛薊賓近些年來被發(fā)現(xiàn)具有良好的抗腫瘤活性，對于多種腫瘤均具有良好抑制作用[13-14]，是一種非常高效且低毒低副作用的天然藥物。本研究不但證實水飛薊賓具有很好的抗乳腺癌細胞增殖的活性，而且還提示了它能有效減弱乳腺癌對周圍組織的侵襲和轉(zhuǎn)移，為水飛薊賓的臨床抗腫瘤應(yīng)用提供了新的理論基礎(chǔ)和前景。

［1］Wang Y，Zhang L，Wang Q，et al.Recent advances in the nanotechnology-based drug delivery of Silybin［J］.JBiomed Nanotechnol，2014，10（4）：543-558.

［2］Akhtar R，Ali M，Mahmood S，et al.Anti-proliferative action of silibinin on human colon adenomatous［J］.cancer HT-29 cells［J］.Nutr Hosp，2014，29（2）：388-392.

［3］ Provinciali M，Papalini F，Smorlesi A，et al.Effect of the silybinphosphatidylcholine complex（IdB 1016）on the development of mammary tumors in HER-2/neu transgenic mice［J］.Cancer Res，2007，67（5）：2022-2029.

［4］Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics［J］.CA Cancer JClin，2009，59（4）：225-249.

［5］Li H，Zhang K，Xiao T，et al.A systematic review ofmatrix metalloproteinase 9 as a biomarker of survival in patients with osteosarcoma［J］.Tumour Biol，2014，35（6）：5487-5491.

［6］Li HC，Cao DC，Shao ZM，et al.Prognostic value of matrix metalloproteinases（MMP-2 and MMP-9）in patients with lymph node-negative breast carcinoma［J］.Breast Cancer Res Treat，2004，88（1）：75-85.

［7］Oskarsson T.Extracellularmatrix components in breast cancer progression and metastasis［J］.Breast，2013，22（Suppl 2）：S66-72.

［8］Falcao AS，Kataoka MS，Pinheiro JJ，et al.A Novel Cell Line Derived from Pleomorphic Adenoma Expresses MMP2，MMP9，TIMP1，TIMP2，and Shows Numeric Chromosomal Anomalies［J］.PLoSOne，2014，9（8）：e105231.

［9］Jang SY，Kim A，Lee JY，et al.Metformin Inhibits Tumor Cell Migration via Down-regulation of MMP9 in Tamoxifen-resistant Breast Cancer Cells［J］.Anticancer Res，2014，34（8）：4127-4134.

［10］Sen T，Dutta A，Chatterjee A.Epigallocatechin-3-gallate（EGCG）downregulates gelatinase-B（MMP-9）by involvement of FAK/ERK/NFkappaB and AP-1 in the human breast cancer cell line MDA-MB-231［J］.Anticancer Drugs，2010，21（6）：632-644.

［11］Fuchs O.Targeting of NF-kappaB signaling pathway，other signaling pathways and epigenetics in therapy of multiple myeloma［J］.Cardiovasc HematolDisord Drug Targets，2013，13（1）：16-34.

［12］Hollenhorst PC.RAS/ERK pathway transcriptional regulation through ETS/AP-1 binding sites［J］.Small GTPases，2012，3（3）：154-158.

［13］Akhtar R，Ali M，Mahmood S，et al.Anti-proliferative action of silibinin on human colon adenomatous.cancer HT-29 cells［J］.Nutr Hosp，2014，29（2）：388-392.

［14］Kumar S，Raina K，AgarwalC，etal.Silibinin strongly inhibits the growth kinetics of colon cancer stem cell-enriched spheroids bymodulating interleukin 4/6-mediated survival signals［J］.Oncotarget，2014，5（13）：4972-4989.

（收稿：2014-08-10 修回：2014-10-31）

Silibinin Inhibits M etastasis and Invasion of Breast Cancer Cells Via Decreasing the Expression of MMP-9 Dependent on MEK/ERK Pathway

CHE Jia. Clinical Laboratory,Zhejiang Provincial Tongde Hopsital, Hangzhou(310012),China

Objective To investigate the effect of silibinin on proliferation and invasion of breast cancer cells and the underlying mechanism.M ethods Human breast cancer cell line MCF-7 were treated with various concentrations of silibinin for 24h,then MTT assay was used to detect cell proliferation.The effect of silibinin on invasion of MCF-7 cells was measured by transwell.The phosphorylation of MEK and ERK proteins and the expression of MM-9 protein were evaluated by western blot.Results The inhibitory rate of silibinin on MCF-7 cell proliferation was（8.9±3.8）%at 20μM,（19.7±4.2）%at 50μM,and（29.8±5.7）%at 100μM,with significant difference compared with control group（P＜0.05）.Typan blue staining rate of MCF-7 cells treated with silibinin at concentration of 50 and 100μM was（16.1±4.8）%and（25.3±5.1）%,respectively,both with significant difference compared with that of control group[（3.4±1.4）%,P＜0.05].Silibinin at concentration of 20,50,and 100μM inhibited the phosphorylation of MEK（0.26±0.03,0.15±0.03,0.11±0.02 vs 0.35±0.04）and ERK（0.23±0.03,0.12±0.02,0.07±0.01 vs 0.32±0.05）proteins.Silibinin of 50 and 100μM decreased the expression of MMP-9 protein（0.18±0.03,0.14±0.02 vs 0.29±0.04）.Silibinin inhibited metastasis and invasion of MCF-7 cells[20μM：（14.3±2.1%）,50μM：（35.6±5.7）%, 100μM：（53.1±6.5）%vs 0].Conclusion Silibinin can inhibit the growth and invasion of breast cancer cells.

Breat cancer;Silibinin;MEK/ERK;MMP-9;Tumor invasion

浙江省立同德醫(yī)院檢驗科（杭州 310012）