趙曉舒, 張娜珍, 劉 敏, 鄧付美, 吳明火*(. 大連理工大學(xué)食品與環(huán)境學(xué)院, 遼寧 盤錦 4; . 大連理工大學(xué)文法學(xué)院, 遼寧 盤錦 4)

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(下)·研究論文

固相萃取法純化制備水飛薊賓和異水飛薊賓

趙曉舒1, 張娜珍2, 劉 敏1, 鄧付美1, 吳明火1*
(1. 大連理工大學(xué)食品與環(huán)境學(xué)院, 遼寧 盤錦 124221; 2. 大連理工大學(xué)文法學(xué)院, 遼寧 盤錦 124221)

水飛薊賓和異水飛薊賓是水飛薊素中的主要有效成分,其純化制備主要借助柱色譜法,制備量大,純化效果好,但過程非常費時。該研究的主要目的是利用更為快速高效的固相萃取(SPE)法從水飛薊粗提物中分離純化水飛薊賓和異水飛薊賓。建立了用于分析水飛薊賓和異水飛薊賓的高相液相色譜法,通過優(yōu)化洗脫梯度,實現(xiàn)了水飛薊賓、異水飛薊賓與其他組分的分離。試用了3種保留機(jī)理不同的SPE填料,包括親水親脂(HLB)填料、親水色譜(HILIC)填料及反相C18硅膠填料。通過對比發(fā)現(xiàn)C18硅膠對目標(biāo)化合物的選擇性最佳。進(jìn)一步控制SPE的淋洗及洗脫條件,收集相應(yīng)的洗脫液,經(jīng)氮吹干燥后得到純化的樣品。提純后的水飛薊賓和異水飛薊賓混合物的純度可達(dá)94%以上。水飛薊賓和異水飛薊賓的平均回收率分別為70.5%～81.7%和66.7%～81.8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.7%～9.4%和1.5%～6.1%。該方法簡單、高效,免去傳統(tǒng)分離純化過程中長時間的柱色譜分離過程,適合制備純度較高的水飛薊賓和異水飛薊賓的二元混合標(biāo)準(zhǔn)樣品。

固相萃取;液相色譜;分離純化;水飛薊賓;異水飛薊賓

水飛薊素是從菊科草本植物水飛薊的種子中提取的黃酮類混合物[1,2],具有保肝、抗氧化和抗腫瘤等多種作用[3-5],主要包括水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊寧和水飛薊亭等[6],其中水飛薊賓是水飛薊素中最主要的活性成分[6,7]。在使用過程中,為提高使用效果并減少未知成分引起的干擾,通過將水飛薊素的粗提物進(jìn)行純化,提高其有效活性成分的含量。

關(guān)于水飛薊賓分離純化的方法較多,主要是一些傳統(tǒng)的方法,如有機(jī)溶劑重結(jié)晶法[8]、柱色譜法[9]等,但這類方法用時較長,如柱色譜法通常需要24 h以上的過柱時間。Celik等[10]利用超臨界二氧化碳直接從水飛薊種子中提取了水飛薊賓,該方法提取效率高,但超臨界萃取的方法選擇性較低,純度不及其他方法。近年來制備色譜法因其高效的分離能力被引入樣品的分離純化中。Liu等[11]采用高速逆流色譜在精制水飛薊賓的同時,也分離純化了水飛薊寧和水飛薊亭等。因水飛薊賓存在兩種手性異構(gòu)體(水飛薊賓A和B),為分別研究其活性,也發(fā)展了一些分離能力更強(qiáng)的方法。Li等[12]用一種制備色譜法對水飛薊賓的兩種手性異構(gòu)體進(jìn)行了分離純化,且重現(xiàn)性良好。Zhao等[13]發(fā)展了一種二元柱循環(huán)制備高效液相色譜,成功分離了水飛薊賓和異水飛薊賓的兩對同分異構(gòu)體,純度達(dá)98%以上。雖然色譜法分離效率高,但該方法對設(shè)備要求普遍較高。還有一些其他方法,如酶法是在酶作用的基礎(chǔ)上,對水飛薊賓進(jìn)行適當(dāng)衍生化,使其衍生物更易借助柱色譜等色譜手段分離,最后脫去衍生基團(tuán)完成水飛薊賓的純化。Kren等[14]借助可擴(kuò)展的化學(xué)酶法在一星期內(nèi)制備了g級的純水飛薊賓的兩種手性異構(gòu)體。Gazak等[15]利用固定化南極假絲酵母酶B制備生產(chǎn)了水飛薊賓的兩種異構(gòu)體。酶法制備雖有很高的選擇性,但是需要多步反應(yīng),反應(yīng)條件不易控制;且酶易失活,成本較高,難以放大制備。這些用于純化拆分水飛薊賓手性異構(gòu)體A和B的方法均不能直接用水飛薊粗提物進(jìn)行上樣,都需先將水飛薊賓進(jìn)行純化。

相比上述純化水飛薊賓的方法,固相萃取(SPE)具有操作簡單、設(shè)備要求低、選擇性好等特點,本文發(fā)展了基于SPE的方法對水飛薊粗提物中的水飛薊賓和異水飛薊賓進(jìn)行純化,為水飛薊素有效成分的高效、快速純化提供了一種新的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Q-Exactive液相色譜-高分辨質(zhì)譜(liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry, LC-HRMS)購于美國Thermo Fisher公司; 2030C型液相色譜(LC-UV)、AUY120電子分析天平購于日本島津公司; Ultimate XB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 3 μm)、固相萃取裝置購于月旭科技(上海)有限公司;高速臺式離心機(jī)購于上海安亭科學(xué)儀器廠;可視氮吹儀購于南京稼竣生物科技有限公司;帶篩板的SPE柱管(30 mL)購于美國安捷倫科技有限公司;超聲波清洗機(jī)購于潔盟清洗設(shè)備有限公司;超純水機(jī)購于上海普力菲爾。

水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)樣品(純度98%)、異水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)樣品(純度98%)、甲酸(色譜純)、甲醇(色譜純)購于阿拉丁試劑公司;水飛薊粗提物(西安一禾生物技術(shù)有限公司);乙腈(色譜純,美國斯百全公司); C18硅膠填料及HILIC(親水色譜)PSA(N-丙基乙二胺)鍵合填料(上海博勢生物科技有限公司);商品化HLB填料(美國Waters公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。實驗室用水均為超純水。

標(biāo)準(zhǔn)樣品水飛薊賓和異水飛薊賓溶于甲醇中,保存在4 ℃冰箱里備用。

1.2 SPE柱的填充及樣品分離

比較了3種不同分離模式的色譜填料:親水親脂型HLB、親水PSA鍵合填料和反相C18硅膠填料。制備SPE柱時,分別稱取1 g填料,將其分散于乙腈中,然后全部轉(zhuǎn)移到帶篩板的SPE空柱管中,并在填料上方再放置一個篩板以防在上樣時柱床被沖得不均勻。上樣前先將各種SPE柱用乙腈進(jìn)行活化。用10 mL 20%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇對HLB柱和C18柱進(jìn)行平衡,用10 mL甲醇對PSA柱進(jìn)行平衡。

在制備上樣液時,先稱取50 mg的水飛薊粗提物,用30 mL 20%甲醇溶解。將溶解的樣品以8 000 r/min的速度離心15 min,取上清液,經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后用于HLB柱及C18柱的上樣。對于PSA柱,則用純的甲醇溶解水飛薊粗提物,經(jīng)相同的處理步驟后上樣。

對SPE的洗脫條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化,分別收集相應(yīng)條件下的洗脫液,在45 ℃下用氮氣吹干。最后用50%甲醇進(jìn)行復(fù)溶,用LC-UV分析樣品中水飛薊賓和異水飛薊賓的含量。

1.3 液相色譜分離及定量分析

在優(yōu)化液相色譜的洗脫梯度時,選用了水飛薊粗提物作為樣品。用LC-HRMS對該粗提物進(jìn)行分離檢測。色譜柱為Ultimate XB-C18柱;柱溫為室溫;進(jìn)樣體積為20 μL。流動相A為水(含0.05%甲酸),流動相B為乙腈(含0.05%甲酸)。洗脫梯度:0～5 min, 35%B～50%B; 5～6 min, 50%B～70%B; 6～7 min, 70%B～95%B; 7～9 min, 95%B。紫外檢測器檢測波長為288 nm。

質(zhì)譜的離子源為ESI,負(fù)離子掃描模式;噴霧電壓為4 kV;離子源溫度為320 ℃;選擇響應(yīng)最高的[M-H]-為母離子,用全掃描方式進(jìn)行檢測。分離結(jié)束后,通過提取水飛薊素的理論質(zhì)荷比(m/z481.114 02)可在色譜圖中找出相應(yīng)的離子峰(質(zhì)量誤差≤5 ppm(5×10-6))。因該LC-HRMS系統(tǒng)同時配有紫外檢測器,可對兩種檢測器下的色譜圖進(jìn)行對比,從而確定目標(biāo)化合物的紫外色譜峰及相應(yīng)的保留時間。完成色譜條件的優(yōu)化之后,則僅用LC-UV作為后續(xù)的樣品分析方法。選用外標(biāo)法定量,配制系列不同質(zhì)量濃度(1、2.5、5、10、20和50 mg/L)的水飛薊賓和異水飛薊賓的標(biāo)準(zhǔn)溶液,依次進(jìn)樣,進(jìn)行液相分析,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。為避免紫外檢測器在不同批次(不同日期)間信號響應(yīng)的差異,在分析樣品前都將在當(dāng)天重新制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-UV方法的建立

經(jīng)LC-HRMS分析后,對圖譜進(jìn)行處理,質(zhì)量誤差設(shè)置為5 ppm(5×10-6),選定水飛薊賓的理論m/z481.114 02提取色譜圖。結(jié)果如圖1所示,因水飛薊素家族中存在多種同分異構(gòu)體,在其粗提物中也發(fā)現(xiàn)了除水飛薊賓和異水飛薊賓之外的其他同分異構(gòu)體色譜峰(暫未用標(biāo)準(zhǔn)樣品驗證其各自對應(yīng)的物質(zhì)),同時也驗證了在該粗提物中確實存在水飛薊賓和異水飛薊賓,但純度不高,需要進(jìn)一步純化。優(yōu)化洗脫梯度后,目標(biāo)化合物可在5 min內(nèi)實現(xiàn)分離,紫外檢測與質(zhì)譜檢測所對應(yīng)的峰相匹配,確定UV色譜圖中所對應(yīng)的峰為水飛薊賓和異水飛薊賓。

在LC-HRMS上完成梯度優(yōu)化之后,使用該色譜洗脫條件在島津2030C型色譜儀上對樣品進(jìn)行分析,結(jié)果見圖2。因液相色譜系統(tǒng)的差異,對應(yīng)的保留時間有所后移。水飛薊賓和異水飛薊賓在6 min內(nèi)實現(xiàn)了基線分離,標(biāo)準(zhǔn)樣品所對應(yīng)的保留時間與水飛薊粗提物中的峰一致。用LC對水飛薊賓和異水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)樣品(10 mg/L)進(jìn)行檢測,在5～6 min間有兩個峰,分別為水飛薊賓和異水飛薊賓。這說明所建的LC-UV方法成功分開了水飛薊賓和異水飛薊賓,同時這兩種成分與其他組分或雜質(zhì)也得到了分離,為后續(xù)的外標(biāo)法定量排除了干擾。并且在1～50 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),兩種目標(biāo)化合物的峰面積與質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r2>0.99),用外標(biāo)法可對目標(biāo)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

圖1 水飛薊粗提物在LC-HRMS及LC-UV上的色譜圖(Thermo Fisher)Fig. 1 Chromatograms of silymarin crude extract byLC-HRMS (LC-high-resolution mass spectrometry) and LC-UV (Thermo Fisher) 1. silybin; 2. isosilybin.

圖2 水飛薊粗提物及水飛薊賓和異水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)樣品的LC-UV色譜圖(島津)Fig. 2 LC-UV chromatograms of the silymarin crudeextract and the standards of silybin and isosilybin (SHIMADZU) 1. silybin; 2. isosilybin.

圖3 3種SPE填料在不同體積分?jǐn)?shù)甲醇洗脫下的LC-UV色譜圖Fig. 3 LC-UV chromatograms of the eluents withdifferent volume percentages of methanol for three different SPE (solid phase extraction) cartridges 1. silybin; 2. isosilybin. PSA: primary secondary amine.

2.2 SPE填料的選擇

對比了HLB填料、PSA鍵合填料和C18硅膠填料填充的SPE柱。上樣后,依次用30%～90%的甲醇(每次5 mL)對HLB柱和C18柱洗脫,洗脫液中水飛薊賓和異水飛薊賓的含量用上述LC-UV測定。對于PSA柱,則用甲醇體積分?jǐn)?shù)由高到低(90%～30%)的洗脫液進(jìn)行洗脫。不同洗脫條件下的結(jié)果如圖3所示。對比HLB填料的7個梯度洗脫圖可以發(fā)現(xiàn),5～6 min出峰的水飛薊賓和異水飛薊賓從50%甲醇洗脫液中開始出現(xiàn),直到80%甲醇洗脫液中目標(biāo)組分的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到了最大,但仍與樣品中的其他物質(zhì)共存,純度不高。在90%甲醇洗脫液的組分中,目標(biāo)組分的純度較為理想,但其濃度過低,導(dǎo)致回收率過低,難以通過優(yōu)化洗脫梯度對目標(biāo)化合物實現(xiàn)高效制備。PSA填料則缺乏選擇性,在90%～30%甲醇洗脫液中,色譜圖無顯著差別,說明目標(biāo)化合物始終不能與樣品中的其他雜質(zhì)分離,該填料不適合本試驗。在C18中,30%～70%甲醇洗脫液中沒有水飛薊賓和異水飛薊賓,在80%甲醇洗脫液中才出現(xiàn),并且30%～80%甲醇洗脫液可以把其他絕大多數(shù)雜質(zhì)洗去,說明選用C18硅膠填料對目標(biāo)化合物具有較好的選擇性,有望通過對洗脫梯度的進(jìn)一步優(yōu)化實現(xiàn)將水飛薊賓和異水飛薊賓同樣品中的其他物質(zhì)分開,因此選用C18鍵合硅膠作為后續(xù)分離的SPE填料。

2.3 C18填料的SPE洗脫梯度優(yōu)化

確定選用C18鍵合硅膠作為SPE填料后,對其洗脫條件進(jìn)一步優(yōu)化,最終確定洗脫過程為:用5 mL 50%甲醇洗3次,用5 mL 60%甲醇洗5次,用5 mL 70%、5 mL 80%和5 mL 90%甲醇依次洗脫1次。結(jié)果如圖4所示,60%甲醇洗脫液中幾乎只有保留較弱的雜質(zhì),目標(biāo)化合物的含量非常少;70%甲醇洗脫液中,目標(biāo)化合物開始流失,同時雜質(zhì)也被進(jìn)一步去除。而在80%和90%甲醇洗脫液中就幾乎只有水飛薊賓和異水飛薊賓的峰,并且雜質(zhì)極少,目標(biāo)化合物的含量顯著提高,因此僅收集80%和90%甲醇的洗脫液進(jìn)行濃縮。

圖4 經(jīng)優(yōu)化洗脫條件后C18填料上不同餾分的LC-UV色譜圖Fig. 4 LC-UV chromatograms of different eluentfractions by methanol on C18 SPE cartridge after the optimization of elution conditions 1. silybin; 2. isosilybin.

2.4 目標(biāo)化合物的純度、回收率及方法的重現(xiàn)性

收集80%～90%甲醇洗脫液,氮氣吹干后,稱量復(fù)溶,然后用LC-UV分析水飛薊賓和異水飛薊賓的含量(見圖5)。

圖5 經(jīng)純化后復(fù)溶樣品的LC-UV色譜圖Fig. 5 LC-UV chromatogram of the reconstituted sample after the purification

為考察方法的準(zhǔn)確度和精密度,對水飛薊賓和異水飛薊賓的回收率和重現(xiàn)性進(jìn)行了評定。連續(xù)做5批次的SPE純化過程,每批次有3組平行樣品。根據(jù)未經(jīng)SPE純化的樣品計算出粗提物中水飛薊賓和異水飛薊賓的平均含量分別為6.8%和1.3%。50.0 mg水飛薊粗提物經(jīng)分離純化后可得到3.0～3.4 mg產(chǎn)品。復(fù)溶后進(jìn)LC-UV測定,提純后的水飛薊賓和異水飛薊賓的質(zhì)量分別為2.4～2.8 mg和0.4～0.5 mg,可得提純樣品中水飛薊賓和異水飛薊賓的含量分別為79.7%～86.5%和14.7%～15.9%,兩者含量相加,可知提純的二元混合樣品的純度均可達(dá)94%以上(對應(yīng)表1中5個批次的質(zhì)量純度分別為94.4%、97.4%、101.4%、99.7%和94.4%)。通過回收率=(提純物的質(zhì)量/該物質(zhì)在水飛薊粗提物中的質(zhì)量)×100%計算水飛薊賓和異水飛薊賓的回收率分別為70.5%～81.7%和66.7%～81.8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2.7%～9.4%和1.5%～6.1%(見表1)。

表1 不同純化批次間水飛薊賓和異水飛薊賓的純度、回收率和重現(xiàn)性(n=3)Table 1 Purities, recoveries and reproducibilities of thepurified silybin and isosilybin in different purified batches (n=3)

Recovery=(mass in the purification/mass in the silymarin extract)×100%.

3 小結(jié)

為純化制備水飛薊賓和異水飛薊賓的二元混合樣品,首先建立了用于分析水飛薊賓和異水飛薊賓的LC-UV分析方法。系統(tǒng)比較了3種不同色譜保留機(jī)理的SPE填料對分離水飛薊賓和異水飛薊賓的選擇性,結(jié)果表明C18硅膠填料的SPE柱對水飛薊粗提物中的水飛薊賓和異水飛薊賓具有更好的選擇性。通過對該C18-SPE柱洗脫條件的進(jìn)一步優(yōu)化,從水飛薊粗提物中成功分離純化了水飛薊賓和異水飛薊賓,一步SPE操作后二者的純度達(dá)94%以上。多批次的結(jié)果顯示,該SPE方法中水飛薊賓和異水飛薊賓的回收率普遍在70%以上,且重現(xiàn)性良好(RSD<10%)。但由于水飛薊賓和異水飛薊賓在SPE柱上的保留行為非常接近,僅用SPE柱目前仍難以將其有效分開收集,所以本實驗只收集到了這兩種物質(zhì)的混合物樣品。該SPE法雖然不能將水飛薊賓和異水飛薊賓分開,但具有純化過程簡單、用時較短、不需要復(fù)雜設(shè)備等優(yōu)點,適合制備水飛薊賓和異水飛薊賓的二元混合標(biāo)準(zhǔn)樣品。此外,該SPE方法也可用于水飛薊素其他同分異構(gòu)體(如水飛薊亭、水飛薊寧)的分離純化,因本論文的主要目的是提純水飛薊賓及異水飛薊賓,暫未對此作進(jìn)一步研究。

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Purification and preparation of silybin and isosilybinby solid phase extraction

ZHAO Xiaoshu1, ZHANG Nazhen2, LIU Min1, DENG Fumei1, WU Minghuo1*
(1.SchoolofFoodandEnvironmental,DalianUniversityofTechnology,Panjin124221,China; 2.SchoolofHumanitiesandLaw,DalianUniversityofTechnology,Panjin124221,China)

Silybin and isosilybin are mainly effective elements of silymarin. To improve the performance of treatment and decrease the side effects from the unknown components, purified silybin and isosilybin are in request. The main purpose of this research was to develop a solid phase extraction (SPE) method for the purification of silybin and isosilybin from silymarin extract. For the analysis of the samples, a liquid chromatography method with ultraviolet detector (LC-UV) was developed to separate the silybin and isosilybin from their impurities. The separation was achieved in 8 min and a total analytical time of 11 min with column washing and equilibration. In the SPE, three different SPE packings were tested, including hydrophilic-lipophilic balance (HLB), hydrophilic interaction chromatography (HILIC) and reverse phase C18 silica microspheres. Based on the selectivity against silybin and isosilybin, the C18 packings were chosen. After the optimization of the elution of SPE, the purity over 94% could be achieved for the silybin and isosilybin mixture with the recoveries of 70.5%-81.7% and 66.7%-81.8%, and the relative standard deviations (RSDs) of 2.7%-9.4% and 1.5%-6.1%, respectively. Though silybin and isosilybin could not be separated from each other by using SPE, this is a useful method for the purification of silybin and isosilybin mixture from the crude extract of their plant seeds due to its simplicity and efficiency.

solid phase extraction (SPE); liquid chromatography (LC); separation and purification; silybin; isosilybin

10.3724/SP.J.1123.2016.08046

2016-08-31

國家自然科學(xué)基金項目(21205058);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助項目(DUT15RC(3)048);大連理工大學(xué)大學(xué)科技園專項項目.

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 21205058); Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. DUT15RC(3)048); Special Project for University Science Park of Dalian University of Technology.

O658

:A

:1000-8713(2017)01-0070-05

*通訊聯(lián)系人.Tel:(0427)2631788,E-mail:wumh@dlut.edu.cn.