石 蒙, 宋志花, 耿旭輝, 吳大朋, 關亞風*(. 中國科學院大連化學物理研究所, 中國科學院分離分析化學重點實驗室, 遼寧 大連 6023; 2. 中國科學院大學, 北京 00049)

鄒漢法研究員紀念專輯(下)·專論與綜述

單細胞分析研究進展

石 蒙1,2, 宋志花1,2, 耿旭輝1, 吳大朋1, 關亞風1*
(1. 中國科學院大連化學物理研究所, 中國科學院分離分析化學重點實驗室, 遼寧 大連 116023; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

單細胞分析可以揭示生命基本單元——細胞物質組成、生理行為的多樣性和差異性,是當今生命分析的主流前沿技術。同時,也對分析技術的定量檢測極限、分辨率和精密操控能力提出了新挑戰(zhàn)。文章著重從單細胞分離、檢測、成像等幾個主要方面,綜述了單細胞技術研究的最新進展,并對分離和檢測技術的發(fā)展作了展望。

單細胞;分離;檢測;成像;綜述

細胞是生物體形態(tài)結構和生命活動的基本單位。細胞在增殖、分化和代謝的過程中內因和外因共同作用,造就了細胞之間的差異性。即使是同源的兩個細胞,細胞內物質組成和含量也會有很大差異[1]。而群體細胞分析只能給出一個穩(wěn)態(tài)的平均結果,無法表征細胞間的差異性。因此,在單細胞水平上對細胞中物質組成及細胞形態(tài)進行研究,對揭示細胞間的差異性和解釋某些生理行為具有重大意義。

單細胞分析技術應具備高靈敏度、高選擇性、高時空分辨等特點,原因如下:(1)單細胞的尺寸小。一般哺乳動物細胞的直徑約為10～20 μm,體積在pL級;植物細胞的直徑在～100 μm,體積在～1 nL。如此小的尺寸給單細胞的獲取和樣品前處理操作造成極大的困難。(2)單細胞中的物質含量極低(zmol～fmol),這就需要更加靈敏的檢測方法。(3)單細胞中組分十分復雜,組分之間的濃度差異較大,跨度達9個數量級[2],因此存在基質干擾問題,進一步增加了檢測難度。(4)細胞在新陳代謝的過程中一直在不斷地變化,需要具有高時空分辨的技術來反映細胞的實時變化。

近來,細胞研究已深入到亞細胞甚至單分子水平。本文著重在分離(高效液相色譜、毛細管電泳)、檢測(激光誘導熒光、質譜、電化學)、成像(超分辨顯微成像、拉曼光譜成像)等幾個主要方面對單細胞分析技術的進展進行綜述,并作簡要展望。

1 分離技術

細胞內源物質組成極度復雜且濃度范圍極寬,例如最簡單的血紅細胞也包含數千種物質,濃度范圍跨度達9個數量級[2]。若要檢測細胞內痕量分子甚至數個分子,必須消除基質干擾,而分離是實現復雜體系中目標物質定量檢測的前提。

1.1 高效液相色譜(HPLC)

高效液相色譜由于具有較高的分離效率,一直被廣泛應用于復雜生物樣品分析。最初,Jorgenson等[3]利用毛細管開管柱液相色譜對單個神經元細胞進行分離,并利用電化學方法檢測其中的神經遞質。隨后,他們又利用微柱液相色譜技術對單個牛腎上腺骨髓細胞中的去甲腎上腺素、腎上腺素、苯乙醇胺、N-甲基轉移酶等物質進行分離檢測[4]。Yu等[5]采用HPLC/ESI-MS/MS技術實現了單細胞中谷胱甘肽的測定。超長微柱液相色譜也已用于單細胞的分離分析:Cha等[6]利用創(chuàng)建的一維和二維多孔層開管毛細管柱-電噴霧質譜分析平臺進行蛋白質組學分析。宮頸癌細胞中的237個肽段以及163個蛋白質被成功鑒定。此外,毛細管填充柱、整體柱、開管柱液相色譜技術等都被陸續(xù)應用于單細胞分析。綜合色譜柱樣品容量和總分離效率,柱內徑為50 μm甚至更小、總柱效≥3萬塔板的微柱,才可能為低濃度目標組分的分析提供基本的分離條件。

1.2 毛細管電泳(CE)

毛細管電泳技術具有很高的分離效能,可對單細胞內復雜組分實現高效分離。由于毛細管電泳的進樣體積與細胞體積相當,并可以與電化學、激光誘導熒光、質譜等檢測技術聯用,使之成為單細胞分析的有力工具[7,8]。Wightman等[9]將毛細管電泳和快速循環(huán)伏安法相結合,可以對單個細胞所釋放的神經遞質進行檢測。Nemes等[10]利用CE-ESI-MS技術,對海蝸牛神經細胞中50種內源化合物進行了分離鑒定,并對6種神經元細胞代謝物的相似度進行評價。隨后,Nemes等[11]又采用CE-ESI-MS (TOF)平臺對海蝸牛和小鼠神經元細胞中的300種代謝物進行分離鑒定,充分揭示了不同類型神經元細胞間的代謝物差異。此方法還可應用于細胞器內的代謝物定量分析。隨后Sweedler研究組[12]又利用CE-ESI-MS平臺對海蝸牛神經元細胞中的15種內生核酸及其衍生物分離后進行定量檢測。此方法對于三磷酸腺苷等物質具有良好的分離重現性和較高的靈敏度。Dovichi研究組[13]采用二維電泳對單個小鼠巨噬細胞中的多種蛋白質實現了快速分離,對相關蛋白質的檢出限達zmol,并揭示了細胞間組分表達的差異。微流控芯片與電泳技術結合,可以將單細胞樣品前處理步驟包括細胞的獲取、進樣、融膜、電泳分離集成于一個微小的芯片上,極大地提高了單細胞分析的自動化操控水平[14]。Mellors等[15]發(fā)展了一種自動化的單細胞分析芯片,將其與ESI-MS相結合,從血紅細胞中成功分離出血紅素和α、β亞基,檢測通量可以達到12細胞/min。Zare等[16]所制作的微流控芯片可以對哺乳動物單細胞內蛋白實現單分子計數,也可對單個藍藻細胞中的β2腎上腺素能受體進行定量分析。毛細管電泳與質譜聯用技術的進一步發(fā)展,也將為單細胞內組分鑒定帶來促進作用[17,18]。毛細管電泳技術在20世紀90年代開始被用于單細胞分析,但由于其重現性較差,因此發(fā)展較慢。將此技術與微流控芯片相結合可以極大地提高分析的重現性和分析通量。有些高度集成化的微流控芯片可以連續(xù)實現單細胞篩選、捕獲、標記、分離與檢測等操作。但芯片上的毛細管電泳柱分離柱效是有限的,所以,將芯片與傳統毛細管電泳結合可有效解決實際樣品分析問題[19]。

2 檢測技術

單細胞中目標物質的絕對量通常很低,一般在fg以下,甚至是zg水平。因此,高靈敏檢測是單細胞分析的必要條件。其中,激光誘導熒光、質譜、電化學檢測最為常見。

2.1 激光誘導熒光檢測技術

激光誘導熒光(LIF)具有極高的靈敏度,是特殊搭建的高靈敏檢測裝置,其檢測極限可達單分子水平[20],但是多數科研級LIF的檢測下限是30～100個熒光分子,且搭建高靈敏度激光誘導熒光檢測器的成本較高。Deng等[21]構建了毛細管電泳-激光誘導熒光檢測(CE-LIF)分析系統,用于探究單個癌細胞對阿霉素(DOX)的吸收行為,研究結果表明:細胞群體內單個細胞對DOX的吸收含量存在較大差異性,RSD值在24.0%～61.1%之間。Yang等[22]采用CE-LIF技術對單細胞所釋放的一氧化氮進行檢測,檢出限可達42 amol。Wang等[23]利用CE-LIF分析細胞中的脂質代謝物,對于熒光標記的鞘脂類和多磷酸肌醇化合物的檢出限可達到10-18～10-20mol,并且該方法顯示了較高的重現性。Zhang等[24]用抗原-異硫氰酸熒光素復合物對細胞中的干擾素進行標記,利用CE-LIF進行分離檢測,能夠定量檢測單個自然殺傷細胞(natural killer cell)中的兩種干擾素,檢出限達zmol。隨著衍生化試劑和光學檢測系統的不斷完善,LIF將具有更高的靈敏度和更加廣闊的應用空間。

2.2 質譜檢測

質譜作為一種非標記檢測技術在單細胞分析方面發(fā)揮著重大作用。特別是質譜成像在近年來飛速發(fā)展,已被用于單細胞內蛋白質、多肽、脂質、糖類、代謝物、藥物等的空間分布研究[25]。目前,基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)和二次粒子質譜(SIMS)成像是最常用的單細胞質譜分析技術。Boggio等[26]利用MALDI成像對真核細胞實現了10 μm的空間分辨率。為了進一步提高質譜成像的分辨率,Zavalin等[27]設計了一款可幾何轉換的真空離子源,用于樣品的多向激光照射,成功實現了細胞和組織在亞細胞尺度的空間分辨。隨后,他們又利用MALDI成像技術對HEK-293細胞內的脂質實現了亞微米級的空間分辨,并且獲得了人胰島細胞內多肽的亞細胞輪廓。SIMS單細胞分析主要集中在疾病診斷[28]、細胞膜上膽固醇和脂質分布、哺乳動物細胞內RNA的亞細胞分布監(jiān)測[29]。最近,Steinhauser等[30]將多同位素質譜成像和nanoSIMS技術相結合,對細胞內DNA進行成像,為細胞分裂過程中DNA的隨機分配提供可靠的實驗數據。但對細胞中含量極低且離子化效率比較低的分子,無法依靠質譜來檢測;另外,單細胞質譜直接分析技術的時間和空間分辨率還比較有限。但是,隨著質譜的空間分辨率和靈敏度的不斷提高,其在單細胞研究中將會發(fā)揮更大的作用。

2.3 電化學檢測

電化學檢測(ECD)靈敏度高(fmol),電極尺寸小(亞微米),時間分辨率高(毫秒),特別適合單細胞微環(huán)境實時監(jiān)測[31]。Zhang等[32]采用ECD方法測定了單個鼠細胞中多巴胺的釋放情況。檢測到不同細胞釋放的多巴胺的含量在0.29～1.28 fmol之間,揭示了相同培養(yǎng)條件下不同細胞表達的差異性。納米尺寸電極可將其對單細胞的擾動降至最低[33]。Li等[34]在2015年發(fā)展了一種非常靈敏的電化學檢測方法,將納米電極插入PC 12細胞中,精確測得了細胞囊泡中游離兒茶酚胺的濃度,并證明兒茶酚胺在囊泡內部的濃度要高于囊泡外部的濃度。Li等[35]將納米電極插入突觸間隙中,用于神經元的胞外分泌和動力學研究。實驗檢測到突觸內部所釋放的神經遞質遠比突觸外部復雜。電化學還可用于檢測單個囊泡釋放的兒茶酚胺、5-羥色胺、胰島素等物質[36,37]。目前,高分辨電化學成像得以快速發(fā)展。Katemann等[38]將掃描電化學顯微鏡與掃描離子電導顯微鏡相結合,實現對雙功能探針的遠程控制,對神經元細胞進行成像研究。但是,電化學檢測的選擇性和抗干擾性能依然有待提高,電極的長期穩(wěn)定性和重復性也是需要解決的問題。

3 成像技術

光學成像是一種非接觸式的分析技術,非常適合對單細胞進行連續(xù)、實時、無損監(jiān)控[39]。

3.1 超分辨熒光顯微成像

超分辨顯微鏡將生物學研究帶入納米時代,也加深了人們對微觀世界的理解,如觀察活細胞內生物大分子與細胞器微結構,以及細胞的動態(tài)變化,對于闡明細胞功能表達、理解生理過程和疾病病理具有重要意義。2008年莊小威研究組[40]發(fā)展了三維超分辨成像技術,橫向分辨率可以達到20～30 nm,軸向分辨率可以達到50～60 nm,實驗中成功觀測到腎細胞的微管結構。2011年,該研究組[41]又利用此技術對活體大腸桿菌細胞的擬核相關蛋白質進行了跟蹤觀察,提出H-NS在染色體重組過程中所發(fā)揮的重要作用,并揭示細菌遺傳物質的組織機制。2012年,該研究組[42]將此技術的橫向分辨率減小至10 nm以下,軸向分辨率小于20 nm,獲得了更加清晰的圖像,進一步揭示了細胞骨架的超微結構。2015年,該研究組[43]結合了單分子成像和計算學方法,可以同時監(jiān)測一個細胞中大約1 000種不同類型的RNA分子的分布情況。隨著高分辨顯微成像及相關技術的發(fā)展,使得研究者能夠更加清晰地看到細胞內部各種動態(tài)變化,有益于各種微觀生化反應的機理研究。在單細胞成像技術不斷發(fā)展的過程中,如何做到無損成像也一直是科學家們在思考的問題。2016年Li等[44]創(chuàng)建了結構光照明顯微技術。在高時空分辨的情況下,可將光源對細胞的傷害降到最低,并可對細胞進行“終身監(jiān)控”。該技術采用超高數值孔徑和內全反射技術,獲得了84 nm以下的分辨率,可對細胞內吞和肌動蛋白細胞骨架的重構過程進行連續(xù)成像。隨后又采用光控開關探針對網格蛋白質小窩實現45～62 nm的分辨率,用于描述激動蛋白和網格蛋白之間的相互作用,并闡明它在細胞內吞過程中所起的作用。隨著超分辨顯微鏡價格的降低和性能的提高,此技術將會在單細胞形態(tài)觀測和熒光成像檢測方面發(fā)揮重要作用。但熒光探針和熒光標記技術的滯后限制了超分辨顯微成像技術的快速發(fā)展,所以亟須發(fā)展出顏色豐富且對細胞毒性較小的熒光染料。此外,多種目標物同時檢測也是一個重要的發(fā)展方向。

3.2 拉曼光譜成像

拉曼光譜可以對非熒光活性分子進行成像,具有選擇性高、無需復雜的樣品前處理等優(yōu)勢,是熒光顯微成像的重要補充。其中,基于納米探針的表面增強拉曼光譜具有單分子靈敏度,可追蹤活細胞內物質組成、分布及其變化[45]。Syme等[46]將4-巰基苯甲酸與銀粒子所組成的SERS納米探針采用被動吸收的方式引入細胞,利用納米探針在細胞內的運動軌跡可以對細胞的分裂過程進行追蹤。是一種快捷、高效、無損、高靈敏度的檢測手段。但是,由于探針的引入會改變細胞的狀態(tài),科學家也一直追求一種無需標記的成像技術,以期在細胞自然生長狀態(tài)下對細胞進行研究。近年來相干拉曼散射技術不斷發(fā)展,已可用于脂質存儲、新陳代謝、細胞分裂和凋亡、軸突的髓鞘再生、藥物細胞吞噬等方面的觀測研究[47]。2011年,Fu等[48]將受激拉曼散射技術與傅里葉變換技術相結合,用于微藻細胞中油類、色素和蛋白質的同時檢測,實現了多種物質的非標記快速定量研究。隨后,Zhang等[49]又將此技術用于單個果蠅和哺乳動物細胞中核酸、脂質、蛋白質以及細胞分裂時期DNA縮合過程的成像分析。但是,目前的各種拉曼光譜成像技術的檢測下限還比較高,只能觀測數千個以上聚集成團的同類分子簇。

4 總結

本文只對幾種代表性的單細胞分析技術進行綜述。但我們并不能忽視其他技術在單細胞分析方面所做的貢獻,如單細胞測序技術使得單細胞基因分析成為可能[50]、流式細胞術極大地提高了單細胞檢測的分析通量。成像技術可在不破壞細胞的前提下,快速、連續(xù)的監(jiān)測細胞的動態(tài)變化。另外,單細胞成像分析與單細胞分離檢測是互補關系,前者研究可標記分子在細胞內的分布和細胞的形態(tài),后者則研究細胞內特定區(qū)域里所含分子的種類和數量。因此,進一步提高單細胞的在線樣品處理能力、無損失分離能力和超高靈敏度檢測能力是單細胞分離檢測技術的發(fā)展方向。

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Latest developments of single cell analysis

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(1.KeyLaboratoryofSeparationScienceforAnalyticalChemistry,DalianInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences,Dalian116023,China; 2.UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China)

Single cell analysis can reveal the cellular components and physiological behavior diversity. It is on the cutting-edge of bio-analytical chemistry. Challenges on detection limit, resolution, and precise manipulation of cells are really tougher than ever before. This review includes the developments of several main techniques about separation, detection and imaging. At last, the future developments in separation and detection are discussed.

single-cell; separation; detection; imaging; review

10.3724/SP.J.1123.2016.08039

2016-08-31

國家自然科學基金項目(21405157);中國科學院重點部署項目(KFZD-SW-203,SW-203-03).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 21405157); Key Program of the Chinese Academy of Sciences (Nos. KFZD-SW-203, SW-203-03).

O658

:A

:1000-8713(2017)01-0105-05

*通訊聯系人.Tel:(0411)84379590,E-mail:guanyafeng@dicp.ac.cn.