毛曉敏

水飛薊賓聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞A549凋亡及機(jī)制

毛曉敏

目的 探討水飛薊賓聯(lián)合順鉑對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的殺傷效應(yīng)及機(jī)制。方法 將人肺癌細(xì)胞A549分別用水飛薊賓、順鉑及兩者聯(lián)合干預(yù)后，采用MTT法檢測(cè)不同干預(yù)方案對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞Bcl－2與Bax的表達(dá)；利用小RNA抑制Bax的表達(dá)后，觀察水飛薊賓聯(lián)合順鉑對(duì)A549細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。結(jié)果 水飛薊賓聯(lián)合順鉑對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制率（69.9±6.8）%,凋亡率（53.5±4.2）%；水飛薊賓對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制率（6.9±0.7）%，凋亡率（7.9±1.5）%；順鉑分別為（13.3±2.9）%和（16.8±2.2）%。水飛薊賓聯(lián)合順鉑治療A549細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率均優(yōu)于單用水飛薊賓和順鉑治療組（P＜0.05）。水飛薊賓聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡依賴于細(xì)胞內(nèi)Bcl－2/Bax的比值，當(dāng)轉(zhuǎn)染Bax si RNA后，水飛薊賓聯(lián)合順鉑對(duì)A549的凋亡誘導(dǎo)率為（27.6±3.0）%，未轉(zhuǎn)染Bax si RNA則兩者聯(lián)合治療A549凋亡誘導(dǎo)率為（50.6±4.7）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 水飛薊賓聯(lián)合順鉑通過降低Bcl－2/Bax比例誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

人肺癌細(xì)胞A549；水飛薊賓；順鉑；凋亡；Bcl－2/Bax

非小細(xì)胞性肺癌約占肺癌的80%[1]，我國(guó)肺癌患者5年存活率不足15%[2]。細(xì)胞毒性化療藥物是治療肺癌的首要治療方法，順鉑是治療非小細(xì)胞肺癌應(yīng)用最廣泛的一線化療藥物之一[3]。然而大劑量化療藥物的毒副作用以及肺癌細(xì)胞逐漸產(chǎn)生的對(duì)化療藥物耐藥性局限了化療藥物的臨床使用，因此，尋找新的能增強(qiáng)順鉑療效的藥物顯得十分必要。水飛薊賓是從水飛薊屬植物奶薊種子中提取的一種黃酮類化合物，其臨床使用的安全性和耐受性很好，目前在美國(guó)及歐洲市場(chǎng)上均廣泛使用[4－5]。研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓具有良好的抗腫瘤作用，能抑制多種類型腫瘤（如乳腺癌，肺癌）細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[6－7]。本文探討水飛薊賓聯(lián)合順鉑對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的殺傷效應(yīng)及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 人肺癌細(xì)胞 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所ATCC，培養(yǎng)在RPMI－1640培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫且通入5%的CO2。

1.2 試 劑 RPIM－1640培養(yǎng)基購(gòu)自于美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程有限公司。水飛薊賓、順鉑、MTT（噻唑藍(lán)）、購(gòu)于美國(guó)Sigma－Aldrich公司。PI和AnnexinⅤ凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)ebioscience公司。β－actin、Bcl－2、Bax抗體購(gòu)自美國(guó)Cell signaling公司，PVDF膜購(gòu)于美國(guó)Millipore公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。Bax siRNA及無(wú)關(guān)對(duì)照siRNA定制于上海吉瑪公司，Bax的siRNA序列為：正向：5'－GAAGCUGAGCGAGUGUCUCUU－3’，反向：5'－GAGACACU CGCUCAGCUUCUU－3’

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 將A549細(xì)胞接種于96孔板，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別加入10、50、100μM的水飛薊賓，2、4、8μM的順鉑，10μM水飛薊賓聯(lián)合2μM順鉑，培養(yǎng)48h，對(duì)照組不加藥物培養(yǎng)48h。之后加5mg/mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，往孔中加150μL二甲亞砜，震蕩使紫色絮狀物完全溶解，570nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率按以下公式計(jì)算：抑制率=（OD對(duì)照組－OD藥物組）/OD對(duì)照組×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡試驗(yàn) 在A549細(xì)胞中分別加入10μM水飛薊賓、2μM順鉑、10μM水飛薊賓聯(lián)合2μM順鉑培養(yǎng)24h，對(duì)照組不加藥物培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，按照試劑說明書將PI和Annexin－V加入細(xì)胞中孵育20min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡。凋亡率為Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例。

1.5 Western bolt檢測(cè)Bcl－2和Bax表達(dá) 在A549細(xì)胞中分別加入10μM水飛薊賓、2μM順鉑、10μM水飛薊賓聯(lián)合2μM順鉑培養(yǎng)24h，對(duì)照組為不加藥物培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，將細(xì)胞裂解后做Western blot檢測(cè)Bcl－2和Bax的表達(dá)，目標(biāo)蛋白表達(dá)量由它們?cè)谀z片上顯色后的灰度與相應(yīng)β－actin的灰度比表示。

1.6 siRNA（小RNA）轉(zhuǎn)染 按照試劑說明書操作步驟將100nM的Bax siRNA或無(wú)關(guān)對(duì)照siRNA用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞培養(yǎng)6h，之后再用水飛薊賓聯(lián)合順鉑治療A549細(xì)胞，檢測(cè)Bcl－2及Bax的表達(dá)，并測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 水飛薊賓聯(lián)合順鉑對(duì)人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的抑制作用 水飛薊賓和順鉑都呈劑量依賴性地抑制A549細(xì)胞的增殖，當(dāng)水飛薊賓濃度達(dá)到50μM時(shí)，和10μM水飛薊賓組相比，抗腫瘤活性明顯提高（P＜0.01）。同樣的，當(dāng)順鉑濃度達(dá)到4μM時(shí)，和2μM順鉑組相比，抗腫瘤活性也明顯提高（P＜0.01），見表1。因此我們選擇10μM水飛薊賓與2μM順鉑兩者聯(lián)合用藥，觀察對(duì)A549細(xì)胞的抑制效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用顯著提高（P＜0.05），見表2。

表1 不同濃度水飛薊賓和順鉑對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用（±s）

表1 不同濃度水飛薊賓和順鉑對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與10μM水飛薊賓組比較，▲P＜0.01；與2μM順鉑組比較，△P＜0.01

組別對(duì)照組10μM水飛薊賓組50μM水飛薊賓組100μM水飛薊賓組2μM順鉑組4μM順鉑組8μM順鉑組孔數(shù) 順鉑濃度（μM）3333333水飛薊賓濃度（μM）0 10 50 100 000 0000248抑制率（%）0 7.5±0.8 36.8±3.2*▲60.4±5.7* 12.5±2.7* 48.4±4.5*△88.6±6.1*

表2 水飛薊賓聯(lián)合順鉑對(duì)A549肺瘤細(xì)胞的抑制作用（±s）

表2 水飛薊賓聯(lián)合順鉑對(duì)A549肺瘤細(xì)胞的抑制作用（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與水飛薊賓組比較，▲P＜0.05；與順鉑組比較，△P＜0.05

組別對(duì)照組水飛薊賓組順鉑組聯(lián)合治療組孔數(shù) 順鉑濃度（μM）3333水飛薊賓濃度（μM）0 10 0 10 0022抑制率（%）0 6.9±0.7* 13.3±2.9* 69.9±6.8*▲△

2.2 水飛薊賓聯(lián)合順鉑對(duì)人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549凋亡誘導(dǎo)作用 水飛薊賓聯(lián)合順鉑可顯著誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡，而水飛薊賓或順鉑單獨(dú)治療組凋亡誘導(dǎo)率明顯較低（P＜0.01）。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，水飛薊賓聯(lián)合順鉑顯著上調(diào)Bax表達(dá)并降低Bcl－2表達(dá)（P＜0.01），見表3。

2.3 水飛薊賓聯(lián)合順鉑對(duì)A549轉(zhuǎn)染Bax siRNA后Bcl－2/Bax比值的影響 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)A549轉(zhuǎn)染Bax siRNA后Bcl－2/Bax比值顯著提高（P＜0.05），且水飛薊賓聯(lián)合順鉑的凋亡誘導(dǎo)能力顯著下降（P＜0.05），表明水飛薊賓聯(lián)合順鉑通過降低Bcl－2/Bax比值誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡。見表4。

表3 水飛薊賓聯(lián)合順鉑對(duì)A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)（±s）

表3 水飛薊賓聯(lián)合順鉑對(duì)A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)（±s）

注：與水飛薊賓組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與順鉑組比較，△P＜0.01

組別對(duì)照組水飛薊賓組順鉑組聯(lián)合治療組孔數(shù)3333水飛薊賓濃度（μM）0 10 0 10順鉑濃度（μM）0022凋亡率（%）2.7±0.6 7.9±1.5 16.8±2.2▲53.5±4.2▲▲△灰度比（Bcl－2/β－actin）0.42±0.09 0.36±0.06 0.31±0.06 0.12±0.03▲▲△灰度比（Bax/β－actin）0.34±0.05 0.31±0.06 0.41±0.08 0.86±0.16▲▲

表4 Bcl－2/Bax比率對(duì)水飛薊賓聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的影響（±s）

表4 Bcl－2/Bax比率對(duì)水飛薊賓聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的影響（±s）

注：與水飛薊賓聯(lián)合順鉑組比較，*P＜0.05

組別對(duì)照組水飛薊賓聯(lián)合順鉑組Bcl－2 siRNA+水飛薊賓聯(lián)合順鉑組孔數(shù)Bax siRNA（nm）333 00 100無(wú)關(guān)siRNA（nm）0 100 0水飛薊賓濃度（μM）0 10 10順鉑濃度（μM）022灰度比（Bcl－2/β－actin）0.39±0.08 0.10±0.02 0.12±0.03灰度比（Bax/β－actin）0.35±0.05 0.84±0.14 0.41±0.08* Bcl－2/Bax比值1.11 0.11 0.29*凋亡率（%）2.8±0.5 50.6±4.7 27.6±3.0*

3 討論

順鉑是目前腫瘤治療的一線藥物，對(duì)肺癌、卵巢癌、乳腺癌等都有十分確切的療效[8－9]，是治療非小細(xì)胞肺癌最為有效的化療藥物，并且常常和其他藥物如吉西他濱和紫杉醇等聯(lián)合使用[10－11]。然而，長(zhǎng)期大劑量應(yīng)用順鉑常常造成嚴(yán)重的腎損害，而腫瘤細(xì)胞則逐漸耐藥[12]，失去對(duì)順鉑的敏感性。

Bcl－2蛋白家族是調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，其中Bcl－2具有抗凋亡效應(yīng)，而Bax的過表達(dá)則誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。當(dāng)Bax蛋白被Bcl－2結(jié)合形成異源二聚體時(shí)，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)為抗凋亡狀態(tài)，而當(dāng)Bax與自身形成同源二聚體時(shí)則通過打開線粒體的膜孔道從而釋放細(xì)胞色素C而誘導(dǎo)凋亡，因此Bcl－2/Bax比率決定著細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡程序[13－14]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)水飛薊賓能顯著增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，使低劑量的順鉑也能有效抑制肺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。進(jìn)一步研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)兩者合用可以降低Bcl－2的表達(dá)并提高Bax的表達(dá)，Bcl－2/Bax比值顯著降低。用Bax siRNA將Bax基因沉默后，水飛薊賓聯(lián)合順鉑對(duì)Bax的誘導(dǎo)效應(yīng)下降，提高了Bcl－2/Bax比值，導(dǎo)致對(duì)A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用下降，表明水飛薊賓聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是通過降低Bcl－2/Bax比值。本研究結(jié)果提示水飛薊賓可以提高順鉑治療肺癌的療效，這可能成為肺癌臨床治療的新方法。

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（收稿：2014-10-06 修回：2014-10-28）

Effect of Silibinin Combined with Cisplatin on Apoptosis of Lung Cancer Cell Line A549 and Its Mecha－nism

MAO Xiaomin.People's Hospital of Jiangshan City,Quzhou(324100),China

Objective To explore anti－tumor activity of silibinin combined with cisplatin on A549 lung cancer cells and the underlying mechanism.Methods A549 cells were treated with silibinin,cisplatin and both.Cell proliferation was measured by using MTT assay.Induction of apoptosis was determined by flow cytometry.The expression of Bcl－2 and Bax was detected by Western blot.The expression of Bax was inhibited by siRNA,then the apoptosis of A549 cells was measured after treatment with both silibinin and cisplatin.Results The proliferation inhibition rate（69.9%±6.8%）and apoptosis rate（53.5%±4.2%）in silibinin combined with cisplatin group,which were significantly higher than those in silibinin group（proliferation inhibition rate 6.9%±0.7%,apoptosis rate 7.9%± 1.5%）and cisplatin group（proliferation inhibition rate 13.3%±2.9%,apoptosis rate 16.8%±2.2%）,with all P＜0.05. The effect of apoptosis induction caused by silibinin combined with cisplatin was dependent on the rate of Bcl－2/ Bax.Transecting with Bax siRNA significantly decreased the apoptosis rate induced by silibinin combined with cisplatin compared to the same treatment but without the transfection of Bax siRNA（27.6%±3.0%vs 50.6%±4.7%,P＜0.05）.Conclusion Silibinin combined with cisplatin can induce apoptosis of A549 cells via decreasing the Bcl－2/ Bax ratio.

lung cancer cell line A549;silibinin;cisplatin;apoptosis;Bcl－2/Bax

浙江省江山市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（江山 324100）