袁海洪

摘要：目的 探討檢測絲裂原活化蛋白激酶激酶-4（MKK4）在骨肉瘤中的表達、發(fā)生發(fā)展及其預后的關系。方法 選取我院骨肉瘤標本28例，應用免疫組化SP法檢測其MKK4的表達。結果 在骨肉瘤細胞核和細胞質中MKK4的表達明顯，MKK4在骨肉瘤細胞質的表達與臨床分期成正相關（r=0.72， P=0.000），MKK4在有轉移的骨肉瘤細胞質中的表達明顯高于無轉移的骨肉瘤（P<0.05），而在細胞核中無明顯差異， 細胞核中MKK4表達的陽性率與骨肉瘤與臨床分期無相關性。結論 MKK4對骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展可能有促進作用，MKK4與骨肉瘤的轉移及預后有關，可作為一個潛在的判斷骨肉瘤預后的一種指標。

關鍵詞：MKK4； 骨肉瘤；表達

MAPK具有傳導增殖信號和凋亡信號的功能，其信號轉導通路在調控細胞分裂、增殖和凋亡過程起著重要的作用，是目前人們認識的最重要的細胞分裂調節(jié)系統(tǒng)，人們也越加關注對MAPK通路與腫瘤調控關系。唯一能同時磷酸化并激活MAPK通路中的P38/MAPK通路和JNK/MAPK通路的激酶是絲裂原活化蛋白激酶激酶-4（MKK4）[1，2]，以往的大量研究證實了在腫瘤的形成及發(fā)展過程中，MKK4 扮演著復雜的角色。研究表明大腸癌、乳腺癌等腫瘤中MKK4表達均有異常，但其在骨肉瘤中的表達情況尚不清楚。本文收集我院2001年1月～2012年12月28例骨肉瘤標本，利用免疫組織化學技術檢測骨肉瘤標本中MKK4蛋白的表達，探討MKK4與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展及其預后的關系，報道如下：

1 資料與方法

1.1一般資料 收集我院2001年1月～2012年12月28例骨肉瘤標本，均經病理確診，男18例，女10例，年齡9～52歲，平均年齡20.09歲；28例標本經10%福爾馬林固定后，Rapid·Immuno脫鈣液脫鈣，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 方法 應用鏈霉菌素-生物素（SP）免疫組化技術分別檢測骨肉瘤組織中MKK4的表達，陽性對照用已知陽性切片，用PBS代替一抗作陰性對照，操作步驟均按試劑盒說明書進行。Rapid·Immuno脫鈣劑為福州邁新生物技術公司產品，Mkk4兔單克隆抗體試劑為美國Epitomics公司產品。

1.3 結果判定 MKK4蛋白表達以細胞核和/或細胞漿出現(xiàn)黃色或棕黃色染色為陽性細胞。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野進行陽性細胞計數(shù)。著色強度分為4級：3級為棕褐色，2級為棕黃色，1級為淺黃色和黃色，O級為無色；陽性細胞比例分為5級：陽性細胞比例>80%為4，陽性細胞比例51～80%為3，陽性細胞比例11%～50%為2，陽性細胞比例≤10%為1，無陽性細胞為0。采用IRS評分法[3]對切片進行免疫組織化學評分，即陽性細胞比例（PP）與染色深度（SI）的乘積（IRS=PP×SI）。兩項合計乘積陰性為0～3，弱陽性為4～6，中等陽性為8，強陽性為9～12。

1.4 統(tǒng)計學處理 對數(shù)據(jù)進行分析處理用的是SPSS17.0統(tǒng)計學分析軟件。對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析及χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義P<0.05。

2 結果

可見異型細胞散在分布在HE染色后的肉瘤組織切片中，并可見由肉瘤細胞直接產生的骨樣組織分布細胞周圍，出現(xiàn)不典型核分裂相（見圖1），MKK4蛋白主要表達于細胞質和細胞核，呈棕黃色或棕褐色，細胞核的染色更深（見圖2）。

骨肉瘤不同臨床分期細胞質中MKK4的表達有明顯差異（χ2=18.18， P=0.001），且與臨床分期呈正相關（r=0.72， P=0.000）；細胞核中MKK4表達的陽性率與骨肉瘤不同臨床分期無明顯差異（χ2=4.17， P=0.20），且與臨床分期無相關性（P=0.08）。MKK4在初診轉移、初診未轉移及術后轉移骨肉瘤中的表達有顯著差異（χ2=9.69， P=0.033）；在三者細胞核中表達無明顯差異（χ2=1.00， P=1.00）。

對骨肉瘤患者進行l(wèi)ogistic分析，提示臨床分期（OR=3.22，P=0.08）、MKK4 在細胞質中高表達（OR=3.01，P=0.12）為骨肉瘤轉移或復發(fā)的危險因素。（見表1）

3 討論

骨肉瘤發(fā)病率占骨原發(fā)性惡性腫瘤第一位，它的發(fā)生涉及到多基因的調控和細胞信號的轉導。絲裂活化蛋白激酶（MAPK）能將細胞外信號轉導到細胞內的重要信號轉導系統(tǒng)，在調控細胞增殖、分裂和凋亡過程中有重要的作用。MKK4是唯一能磷酸化并激活MAPK中的P38通路和JNK通路的激酶，作為MAPK信號轉導通路的重要上游激酶，參與到細胞的增殖、分化、衰老等過程，從而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程中起到調控作用[4]。

目前，尚不明確MKK4是抑癌基因還是原癌基因。部分研究顯示， MKK4 為抑癌基因， 具有腫瘤抑制作用[5]。但也有研究指出MKK4為癌基因，具有致腫瘤作用[6]。 本實驗應用免疫組織化學技術檢測骨肉瘤中MAPK上游激酶MKK4蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)MKK4在骨肉瘤組織的細胞核及細胞質中均有明顯表達，骨肉瘤不同臨床分期細胞質中MKK4的表達有明顯差異，且與臨床分期呈正相關；細胞核中MKK4表達的陽性率與骨肉瘤不同臨床分期無明顯差異，且與臨床分期無相關性。證明了MKK4在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中起一定的促進作用，MKK4表達越多，下游底物活化越多，且與腫瘤惡性程度相關。MKK4在初診轉移、初診未轉移及術后轉移骨肉瘤中的表達：MKK4在三者細胞質中的表達有顯著差異；在三者細胞核中表達無明顯差異，MKK4在初診轉移骨肉瘤組織細胞質中的表達高于初診無轉移的，而細胞核中的表達情況無明顯差異，提示骨肉瘤細胞質中MKK4高表達可能與骨肉瘤轉移有關，可作為一個潛在的判斷骨肉瘤預后的指標之一。本實驗提示MKK4在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中有促進作用，且與骨肉瘤的預后有關，可能為原癌基因。

到目前為止， MKK4尚不能被定義為一個單純的原癌基因或抑癌基因，其與腫瘤關系還存在爭議， 這需我們對其更進一步深入研究。

參考文獻：

[1]Derijard B， Raingeaud J， Barrett T， Wu IH， Han J， Ulevitch RJ， Davis RJ： Independent human MAP-kinase signal transduction pathways defined by MEK and .

[2]鄭建明 雷蔡： 細胞分裂素活化蛋白激酶在骨肉瘤中的表達及其意義[J]. 中國矯形外科雜志 2006， 14（20）：1579.

[3]Chang L， Karin M.Mammalian MAP kinase signalling cascades[J].Nature 2001，410（6824）：37-40.

[4]Whitmarsh AJ， Davis RJ： Role of mitogen-activated protein kinase kinase 4 in cancer. Oncogene，2007， 26（22）：3172-3184.

[5]Stark AM， Tongers K， Maass N，et al. Reduced metastasis-suppressorgene mRNA-expression in breast cancer brain metastases [J]. CancerRes Clin Oncol，2005，131：191-198.

[6]黃闖， 張學淵， 魏運軍， 等. MKK4 基因在喉鱗癌中的表達及其臨床意義[J]. 腫瘤， 2009， 29（ 9） ： 898 -901.

編輯/王海靜