摘要：本文對近年來引起延邊豬突然死亡的主要病毒進行分離鑒定，進而為疫苗的研發(fā)奠定基礎，通過對致病細菌培養(yǎng)、細菌形態(tài)學觀察、細菌培養(yǎng)特性鑒定、細菌生化鑒定、動物接種以及藥敏試驗的方法對延邊豬巴氏桿進行分離培養(yǎng)與鑒定。試驗結果表明該病菌于厭氧條件在兔鮮血瓊脂平板生長狀態(tài)良好；革蘭氏染色呈陽性，鏡檢呈圓形、鏈狀；甲基紅試驗呈紅色；能夠產(chǎn)生H2S氣體；藥敏試驗該菌株對阿莫西林和先鋒V高度敏感。從疑似發(fā)生延邊豬巴氏桿菌病患豬的肺臟和淋巴結中可以分離到巴氏桿菌。

關鍵詞：巴氏桿菌；分離；鑒定

中圖分類號： S852 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2015.06.036

巴氏桿菌的種類繁多，在自然界分布很廣，呈圓形或橢圓形排列成長短不一的鏈，其易感動物較多，動物巴氏桿菌病中以豬、牛、羊、馬較常見。近年來，水貂、魚、兔、熊也有發(fā)生巴氏桿菌病的報道。巴氏桿菌病是由β溶血性巴氏桿菌引起的多種人獸共患病的總稱。根據(jù)患病豬的臨床癥狀和發(fā)病機理不同，可以看出它是感染的巴氏桿菌的種類不一樣，所以分為腦膜炎型、關節(jié)腫脹型、化膿性淤血淋巴結炎型，還有敗血癥型[1]。隨著經(jīng)濟發(fā)展，人們對養(yǎng)殖業(yè)的熱衷，延邊豬患有巴氏桿菌病死亡數(shù)也在增加。2014年3月，吉林省某養(yǎng)殖場延邊豬死亡，延邊豬由于疾病導致死亡的問題引起大家的重視，所以本實驗通過細菌培養(yǎng)、細菌形態(tài)學觀察、細菌培養(yǎng)特性鑒定、細菌生化鑒定、動物接種以及藥敏試驗的方法對延邊豬巴氏桿菌進行分離與鑒定。

1材料與方法

1.1 主要試劑和實驗動物

麥康凱瓊脂平板、血瓊脂平板和普通瓊脂平板均自行配制；革蘭氏染色試劑和藥敏試紙購自福州富利達生物實驗制品有限公司，生化試劑購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；小鼠購自長春。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng) 將患病解剖，觀察，取樣，然后將豬的脾、肺淋巴結等組織進行劃線，接種于血清LB平板做細菌分離培養(yǎng)和組織觸片檢查，置37 ℃厭氧培養(yǎng)20～24小時后在試驗臺上觀察結果，挑取多個單個被懷疑是巴氏桿菌的菌落做純凈的培養(yǎng)。

1.2.2 單個細菌形態(tài)外貌及生長特性的觀察 將上述已經(jīng)分離純化生長非常好的單個菌株一類接種于普通瓊脂平板，另一類接種于麥康凱瓊脂平板，將它們分別置于37℃有氧和無氧條件下進行單獨培養(yǎng)，然后觀察他們的生長表現(xiàn)和形態(tài)狀況等[2]。與此同時對這些菌株的溫度、時間、培養(yǎng)的環(huán)境、營養(yǎng)需求分別與空白組進行對比試驗[3]。然后挑取液體和固體培養(yǎng)基中的菌進行涂片，染色，鏡檢及進一步觀察。

1.2.3 細菌生化鑒定 根據(jù)生化鑒定使用說明書，按照步驟將細菌分別接種到葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、鼠李糖、甘露醇生化鑒定管中，37 ℃培養(yǎng)8～24小時后觀察結果。做甲基紅實驗、硫化氫（H2S）實驗、過氧化酶實驗鑒定巴氏桿菌。

1.2.4動物接種試驗 隨機選用無菌飼養(yǎng)小鼠8只，設置試驗組和對照組，各4只。試驗組，分別在小鼠腹腔接種不同梯度稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4）菌液0.5毫升，對照組用滅菌生理鹽水代替。并將兩組小鼠在相同的環(huán)境條件，隔離觀察飼養(yǎng)，24小時后觀察小鼠發(fā)病或死亡的表現(xiàn)，同時剖檢致病小鼠，取小鼠內(nèi)臟進行病原菌的分離培養(yǎng)鑒定與分析。藥敏試驗操作步驟按常規(guī)試紙片法進行。

2 結果

2.1 細菌形態(tài)學觀察

從小鼠的脾臟中分離得到1 株病原菌，在兔鮮血瓊脂平板上厭氧培養(yǎng)18～24小時后進行觀察，菌落呈現(xiàn)針尖大小、橢圓形或圓形、局部有隆起、邊緣整齊，顏色為灰白色或微灰色；呈革蘭氏染色陽性，顯微鏡下呈圓形的鏈條形狀菌體。

2.2 細菌培養(yǎng)特征鑒定

鑒定結果表明，該菌在麥康凱瓊脂平板上置于厭氧和有氧條件下均不生長，在普通瓊脂平板上幾乎無菌體生長，在有兔鮮血瓊脂平板置于厭氧環(huán)境培養(yǎng)時，生長狀態(tài)良好，置于有氧條件下生長狀態(tài)不好。挑取單個生長菌落分別進行涂片觀察，結果顯示，革蘭氏染色后鏡檢，均呈陽性、圓形或橢圓形，長、短鏈形狀呈現(xiàn)不均一排列。

2.3 細菌生化鑒定

接種7種生化試劑后發(fā)現(xiàn)，該菌不發(fā)酵乳糖、葡萄糖、鼠李糖，發(fā)酵麥芽糖、果糖、蔗糖、甘露醇。

甲基紅實驗，使用甲基紅試劑，培養(yǎng)液變成紅色。

硫化氫（H2S），使用實驗醋酸鉛斜面培養(yǎng)基，在穿刺線周圍出現(xiàn)黑色。

過氧化酶實驗，使用H2O2，有氣泡產(chǎn)生。

2.4動物實驗病原菌

接種小鼠后，小鼠出現(xiàn)了不同程度的抑郁，食欲不振，精神萎靡等癥狀， 12小時過后小鼠全部死亡，然后對小鼠剖檢，觀察到肝臟明顯肥大。

2.5藥敏試驗

該試驗結果進一步表明，分離菌株對阿莫西林和先鋒V 藥物高度敏感，而對菌必治、呋喃妥因、慶大霉素和磺胺類藥中度敏感，對青霉素、鏈霉素、卡那霉素、蒽諾沙星、復方新諾明、環(huán)丙沙星不敏感。

3 討論

依據(jù)菌體感染小鼠內(nèi)臟的分析與鑒定結果，以及延邊豬場近期該病的感染狀況等，最終將該豬場發(fā)生的疫病定為巴氏桿菌感染。該致病菌在有氧和厭氧條件下，在麥康凱瓊脂平板上均不生長，在普通瓊脂平板上生長極少，而在厭氧比有氧條件下，在鮮血瓊脂平板上生長狀態(tài)非常好。挑取單個生長菌落涂片，革蘭氏染色后鏡檢，均呈巴氏桿菌陽性，形態(tài)呈圓形，并呈長短鏈狀排列。

分離獲得的菌株對先鋒V和阿莫西林均高度敏感，對呋喃妥因、磺胺類藥和菌必治等中度敏感，對復方新諾明、鏈霉素、青霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星類藥物等極不敏感。

對于此現(xiàn)象，要加強管理，及時消毒，全面做好免疫工作，做好疾病防控。

參考文獻

[1] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：155-162.

[2] 陸承平.獸醫(yī)微生物學[M]北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007.

[3] 倪宏波， 王興龍.長春地區(qū)豬巴氏桿菌分離株的病原特性研究[ J] .黑龍江八一農(nóng)墾大學學報， 2002， 14（1）：64-76.

作者簡介：張闖，碩士，延邊大學農(nóng)學院獸醫(yī)預防實驗室，研究方向：動物傳染病分子生物學。endprint