白雪松

(黃山學(xué)院 體育學(xué)院，安徽 黃山245000)

豆渣是大豆加工成產(chǎn)品，進(jìn)行漿液分離后得到的副產(chǎn)物，因其口感較差，大多用于飼料中。近年來，豆渣營養(yǎng)成分的研究漸漸成為了一個(gè)熱點(diǎn)問題。研究發(fā)現(xiàn)，豆渣中的膳食纖維含量為50%左右，粗脂肪6%～12%，粗蛋白質(zhì)15%～20，碳水化合物20%左右，還含有多種蛋白質(zhì)和維生素，是一種具有多種功能性的物質(zhì)［1，2］?，F(xiàn)階段，豆渣研究中蛋白較多，對(duì)豆渣中維生素E 提取方面缺少深入的研究。

維生素E 又名生育酚或產(chǎn)妊酚，是一種有8 種形式的脂溶性維生素，是人體必需的維生素之一。維生素E 為金黃色或淡黃色的粘稠油狀物，具有一種溫和的、特殊的氣味。維生素E 的機(jī)能是多種多樣的。目前，國內(nèi)外消費(fèi)者對(duì)維生素E 的保健功能逐漸重視起來，作為食品工業(yè)的營養(yǎng)增補(bǔ)劑受到了人們的認(rèn)可，維生素E 更適用于生產(chǎn)各種功能保健強(qiáng)化食品，特別是用作運(yùn)動(dòng)員的營養(yǎng)補(bǔ)充劑，提高無氧運(yùn)動(dòng)后人體力的恢復(fù)能力，保持較高的抗氧化酶活性，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織都建議人體每天補(bǔ)充適量的維生素E以滿足人體的需求［3］。

羅吉偉等［4］研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞壞死丟失，線粒體形態(tài)異常，口服維生素E 對(duì)反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌線粒體具有保護(hù)作用，減少反復(fù)力竭收縮骨骼肌的壞死丟失。宋吉銳等［5］證明維生素E 降低骨骼肌細(xì)胞線粒體丙二醛的含量，增加細(xì)胞線粒體超氧化物歧化酶的活性，提高骨骼肌細(xì)胞的抗氧化能力，進(jìn)而可減輕自由基對(duì)肌肉的損傷作用，維生素E 通過抗氧化作用預(yù)防了運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷。國外學(xué)者認(rèn)為，維生素E 的衍生物可增強(qiáng)肌纖維膜、線粒體膜和肌漿網(wǎng)膜的穩(wěn)定性和完整性，防止肌漿內(nèi)Ca2+的大量溢出引發(fā)的骨骼肌損傷［6］。

本文通過溶劑浸提方法提取豆渣中的維生素E，實(shí)現(xiàn)了豆渣副產(chǎn)物的再利用。探討了浸提時(shí)間、不同料液比、浸提溫度等對(duì)維生素E 提取得率的影響，并通過響應(yīng)面進(jìn)行工藝條件優(yōu)化。豆渣中提取的維生素E用于提高無氧運(yùn)動(dòng)中大鼠骨骼肌損傷預(yù)防能力的研究，為預(yù)防運(yùn)動(dòng)損傷提供科學(xué)的借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

正己烷、丙酮、無水乙醇(化學(xué)試劑廠);石油醚、磷酸、異丙醇(西隴化工股份有限公司);菲繞啉(天津一方科技有限公司);三氯化鐵(天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠);氫氧化鈉(鄭州金峰達(dá)化工產(chǎn)品有限公司);維生素E 標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度為1.000g/L 維生素E 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，質(zhì)量濃度為0.001g/L(安徽宇寧科技有限公司);成年SD 大鼠50 只，鼠齡10 周，體重220～250g(健康普通級(jí)，由長春應(yīng)化所提供);生長環(huán)境溫度20 ～25℃，相對(duì)濕度50%～70%。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與儀器

FA1004A 分析天平 上海達(dá)平儀器有限公司;DHG－9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;LXJ 離心沉淀機(jī) 上海精密科學(xué)儀器有限公司AFS－230E 原子熒光分光光度計(jì) 北京陽光億事達(dá)有限公司;;80－1 電動(dòng)離心機(jī) 金壇市科希儀器有限公司;M11139 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 西化儀科技有限公司;HH－600 數(shù)顯三用恒溫水鍋 上海谷寧儀器有限公司;PLVW 真空泵 萬得勒機(jī)械設(shè)備有限公司;HPD－25 型固相萃取儀:上海楚定分析儀器有限公司;

1.3 提取工藝和測定方法

豆渣→預(yù)處理→乙醇浸提→離心→浸出混合物脫醇并回收乙醇→VE 富集物→丙酮脫膠→離心→旋蒸回收丙酮→脫色→離心去掉脫色劑→皂化→固相萃取純化→正己烷洗脫液→測定維生素E 吸光度。

較為理想的浸提溶劑需具有較強(qiáng)溶解力強(qiáng)、回收溶液、安全無毒、價(jià)格便宜，盡量降低成本與消耗，實(shí)驗(yàn)中以正己烷、無水乙醇和甲醇實(shí)驗(yàn)室較為常用的溶劑作為單因素條件，將豆渣進(jìn)行預(yù)處理，料液比初選1:3，在60°C 的提取溫度下提取2 小時(shí)，比較維生素E 的吸光值，選出最佳溶劑［7］。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:準(zhǔn)確稱取10mg 生育酚于小燒杯中，用無水乙醇溶解，加入一定量的抗壞血酸，將其轉(zhuǎn)移至100ml 棕色容量瓶中，定容，搖勻。(質(zhì)量濃度為100μg/ml)。

1.4.2 梯度配制:將母液濃縮30 倍后，分別取0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml 于10ml 容量瓶中，無水乙醇定容至刻度，使得質(zhì)量濃度分別為0μg/ml、30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml、120μg/ml、150μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)溶液(考慮到儀器性能的限制，吸光度在0.1～0.9 之間時(shí)，測量誤差較小，因此維生素E 的測定濃度在20 ～150μg/ml 為宜)［8］。

1.4.3 比色:分別取2ml 標(biāo)準(zhǔn)液，加入2g/L 三氯化鐵無水乙醇溶液2ml，混合均勻，加入5g/L 1，10－菲繞啉無水乙醇溶液2ml，混勻，靜置5 分鐘，加入19.6g/L 磷酸無水乙醇溶液2ml 終止反應(yīng)，在分光光度計(jì)520nm下測定吸光值。平行做空白試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線測定重復(fù)4 次［9］。樣品VE 濃度的測定步驟類似。

圖1 維生素E 的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5 大鼠運(yùn)動(dòng)方案及訓(xùn)練模型的建立

1.5.1 大鼠分組與運(yùn)動(dòng)方案

將50 只大鼠隨機(jī)分為5 組，對(duì)照組10 只(A 組)，采用安靜狀態(tài)下的培育，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組10 只(B 組)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練給藥組30 只(C 組)，根據(jù)給藥劑量不同分為三組:0.1g·kg－1體重(C1)，0.2g·kg－1體重(C2)，0.4g·kg－1體重(C3)，B、C 組按照訓(xùn)練模型進(jìn)行6 周的游泳運(yùn)動(dòng)。

1.5.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練模型

游泳條件:游泳池水深超過大鼠身體長度的2 倍，水溫(30±0.5℃)，每池5 只大鼠。進(jìn)行正式訓(xùn)練測定前，對(duì)大鼠進(jìn)行3 天適應(yīng)性訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)間分別為15min、20min、30min，訴后進(jìn)行正式游泳訓(xùn)練，每天8 次，每次練習(xí)游泳10s，休息10s，尾部負(fù)重游泳，負(fù)重量時(shí)間隨時(shí)間變化，體重13%(1、2 周)、15%(3、4 周)、18%(5、6 周)，觀察大鼠運(yùn)動(dòng)能力［10］。6 周后第2 日，取樣，進(jìn)行丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)，進(jìn)行運(yùn)動(dòng)后脂質(zhì)過氧化作用的研究［8］。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.1.1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以浸提溶劑、提取次數(shù)、提取溫度、提取時(shí)間和料液比為單因素，確定最佳的提取工藝，以其實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，采用響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)，以溫度、時(shí)間和料液比為條件，以維生素E 濃度為響應(yīng)值，研究其對(duì)豆渣中維生素E 提取率的影響，每個(gè)因素設(shè)三個(gè)水平，因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化因素水平表

表2 Box－Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 試驗(yàn)結(jié)果回歸分析

依據(jù)Box－Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，采用三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行工藝優(yōu)化，其試驗(yàn)組合及結(jié)果如表2 所示，方差分析顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表3 所示。

據(jù)表2 結(jié)果計(jì)算各項(xiàng)回歸系數(shù)，以回歸系數(shù)建立維生素E 濃度與提取時(shí)間A、提取溫度B 和料液比C 3個(gè)因子的數(shù)學(xué)回歸模型，模型回歸檢驗(yàn)F=68.73，在0.01 水平上差異極顯著。失擬檢驗(yàn)F=19.89，差異不顯著，模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。編碼因素A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2差異顯著，優(yōu)化模型的編碼方程為:y=7.79－1.07A－1.01B+1.75C－1.12AB+1.39AC+0.90BC－1.19A2－1.96B2－1.23C2，從回歸方程可知，方程一次項(xiàng)為高度顯著因素，即提取溫度，、提取時(shí)間和料液比對(duì)維生素E 的得率有高度顯著影響;二次項(xiàng)A2、B2、C2極顯著(P＜0.01)，即三因素之間存在明顯的二次關(guān)系。

2.1.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

根據(jù)二次回歸方程繪制的響應(yīng)面結(jié)果如圖2 所示:

圖2 大豆豆渣的提取響應(yīng)面圖

從圖2a 可知，提取時(shí)間和提取溫度之間有高度顯著的交互作用(P＜0.01)，在選定的條件范圍內(nèi)，提取效果較好的值都落在了提取時(shí)間和提取溫度的中間區(qū)域。保持提取時(shí)間固定，維生素E 濃度隨溫度增大而增大，在65～68℃達(dá)最大值;保持提取溫度固定，樣品維生素E 濃度隨提取時(shí)間延長而增加，100min 時(shí)達(dá)最大值。

從圖2b 可知，提取溫度和提取料液比之間有高度顯著的交互作用(P＜0.01)，在選定的條件范圍內(nèi)，提取效果較好的值都落在了提取時(shí)間和料液比的中間區(qū)域。保持提取時(shí)間固定，維生素E 濃度隨料液比減小而先增大后減小，在0.40～0.45 達(dá)最大值，之后逐漸減少;保持料液比固定，樣品維生素E 濃度提取時(shí)間增加而增大，100～110min 達(dá)最大值。

從圖2c 可知，提取時(shí)間和料液比之間有高度顯著的交互作用(P＜0.01)，提取效果較好的值都落在料液比和提取時(shí)間的中間區(qū)域。保持提取時(shí)間固定，維生素E 濃度隨料液比增加而增大，0.40 ～0.45 時(shí)達(dá)最大值;保持料液比固定，維生素E 濃度隨提取時(shí)間延長而增大，65℃左右時(shí)達(dá)到最大值，后呈下降趨勢。

結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析可知，豆渣蛋白提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為提取溫度為67.78℃，提取時(shí)間為100.30min，提取料液比為1:2.37，在此工藝基礎(chǔ)上，預(yù)測豆渣中維生素E 的濃度為8.32μg/100g。為進(jìn)一步檢驗(yàn)響應(yīng)面分析結(jié)果的可靠性，采用上述最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測定樣品豆渣中維生素E 濃度為8.01μg/100g，與理論值相比，誤差較小，因此，采用響應(yīng)面分析優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際操作。

2.2 維生素E 對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)中骨骼肌的影響

表4 攝入維生素E 濃度對(duì)大鼠體重及負(fù)重游泳時(shí)間的影響

表5 游泳后骨骼肌細(xì)胞線粒體中的丙二醛含量(MDA)、超氧化物歧化酶活力(SOD)

由表4 可知，結(jié)束時(shí)，大鼠的體質(zhì)量有所增加，但大鼠的初始時(shí)體質(zhì)量與結(jié)束時(shí)體質(zhì)量，各組之間不存在顯著性差異(P＞0.05)，所以維生素E 未引起體重的過快增長，且未影響大鼠的正常發(fā)育。運(yùn)動(dòng)中，自由基的變化與骨骼肌微損傷有著密切的關(guān)系。由表5A、B 可知，大鼠運(yùn)動(dòng)后骨骼肌線粒體中的MDA 和SOD 均顯著升高。C1，C2 組與A 與的MDA 差異不顯著，故維生素E 的給藥使自由基的生成明顯減少，機(jī)體細(xì)胞膜的穩(wěn)定性增強(qiáng);C 組與A 組的SOD 皆存在顯著性差異，C2、C3 組與B 組亦存在顯著性差異，故維生素E 的給藥能保持機(jī)體的抗氧化活性，通過抗氧化作用提高機(jī)體損傷的預(yù)防作用。

3 結(jié)論

維生素E 是一種強(qiáng)抗氧化劑，其有許多功效，最突出的化學(xué)性質(zhì)是抗氧化作用。通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化，得到豆渣蛋白提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為提取溫度為67.78℃，提取時(shí)間為100.30min，提取料液比為1:2.37，在此工藝基礎(chǔ)上，預(yù)測豆渣中維生素E 的濃度為8.32μg/100g，實(shí)際測定濃度為8.01μg/100g。此外，用豆渣中提取的維生素E 進(jìn)行了對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)中骨骼肌細(xì)胞線粒體中的丙二醛含量(MDA)、超氧化物歧化酶活力(SOD)的變化研究，結(jié)果顯示，給藥的大鼠負(fù)重游泳時(shí)間顯著增加，延緩運(yùn)動(dòng)中MDA 的增加，保持較高的SOD 活性，提高了運(yùn)動(dòng)中機(jī)體的抗氧化活力，對(duì)運(yùn)動(dòng)中的微損傷的預(yù)防有著重要的作用。

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