郭菊卉+田娟+石桃雄+陳慶富

摘要：以貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心建立的兩個(gè)甜蕎（Fagopyrum esculentum）重組自交系群體（Homo×甜自100和Lorena-3×甜自21-1）的親本為研究對(duì)象，選取了5個(gè)多態(tài)性好、帶型清楚的隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD分析，計(jì)算了每對(duì)親本之間的相似度系數(shù)，并構(gòu)建了各親本的RAPD指紋圖譜。結(jié)果表明，在Homo×甜自100和Lorena-3×甜自21-1的親本中，平均相似度系數(shù)分別為39.13%和42.69%;在構(gòu)建的RAPD指紋圖譜中，有29條譜帶為Homo（P1）所獨(dú)有，27條譜帶為甜自100（P2）所特有;有26條譜帶為L(zhǎng)orena-3（P1）所獨(dú)有，25條譜帶為甜自21-1（P2）所特有。蕎麥特異譜帶可以作為品種鑒定的分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：甜蕎（Fagopyrum esculentum）;RAPD;多樣性;DNA指紋圖譜

中圖分類(lèi)號(hào)：S517 ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）02-0284-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.008

The Diversity Analysis of Parents of Common Buckwheat RIL Populations

with RAPD Markers

GUO Ju-hui，TIAN Juan，SHI Tao-xiong，CHEN Qing-fu

（Research Center of Buckwheat Industry Technology/Institute of Plant Genetics and Breeding， School of Life Science，

Guizhou Normal University， Guiyang 550001， China）

Abstract： The genomic polymorphisms of four parents of two common buckwheat RIL populations were analyzed with RAPD markers of 5 random primers. The results showed that there were the average index of similarity of 39.13% and 42.69% in the parents of the crosses Homo×Tianzi 100 and Lorena-3×Tianzi 21-1， respectively. There were 29 unique bands for Homo（P1） and 27 for Tianzi 100 in the first cross，and 26 for Lorena-3 and 25 for Tianzi 21-1 in the second cross.

Key words：common buckwheat; RAPD; diversity; DNA fingerprint

甜蕎（Fagopyrum esculentum）為蕎麥大粒組類(lèi)群7個(gè)生物學(xué)物種之一[1]。Chen[2，3]的試驗(yàn)研究表明，普通蕎麥中存在著大量的形態(tài)變異，而對(duì)這些變異進(jìn)行深入研究將在很大程度上有利于遺傳育種。基因控制著生物體的性狀表達(dá)和變異，研究DNA分子的多態(tài)性也會(huì)促進(jìn)對(duì)形態(tài)變異的進(jìn)一步探索，并在遺傳育種中為選擇強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合的親本進(jìn)行雜交和蕎麥資源的鑒定提供科學(xué)依據(jù)[4]。

RAPD技術(shù)是以PCR為基礎(chǔ)的一項(xiàng)檢測(cè)物種DNA多態(tài)性的分子技術(shù)[5]。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是DNA樣品需求量小;無(wú)種屬和基因組結(jié)構(gòu)特異性，一套引物可用于不同生物基因組分析;試驗(yàn)成本低;試驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度較快。RAPD在蕎麥中應(yīng)用主要集中在蕎麥的遺傳多樣性和種間系統(tǒng)關(guān)系研究方面[6]。通過(guò)建立RAPD指紋圖譜，尋找每個(gè)種類(lèi)的恒定譜帶和獨(dú)特譜帶，可以迅速準(zhǔn)確地對(duì)蕎麥種類(lèi)進(jìn)行鑒別。近年來(lái)，RAPD技術(shù)已應(yīng)用于多種植物雜交組合后代鑒定[7，8]和種子純度的檢測(cè)等。Ohinshi等[9]、Tsuji等[10]利用AFLP和RAPD技術(shù)研究苦蕎栽培品系和天然種群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。Sharma[11]應(yīng)用RAPD技術(shù)研究了蕎麥屬14個(gè)種之間的遺傳多樣性。Kump等[12，13]采用RAPD技術(shù)進(jìn)行了苦蕎33個(gè)栽培種之間遺傳關(guān)系的分析。許瑾等[4]利用RAPD技術(shù)對(duì)蕎麥屬的9個(gè)品種進(jìn)行基因組指紋圖譜分析。譚萍等[14]采用RAPD方法對(duì)國(guó)內(nèi)10個(gè)蕎麥栽培種進(jìn)行基因型分析，并建立了指紋圖譜。Pan等[15]以F. esculentum Moench， F. esculentum var. homotropicum 及其雜交所建立的 225 株 F2代分離群體為材料，進(jìn)行了 RAPD 與 STS 標(biāo)記分析和重要形態(tài)性狀遺傳分析，并由此構(gòu)建遺傳標(biāo)記連鎖圖譜，共涉及87個(gè)RAPD標(biāo)記，12個(gè)STS標(biāo)記。覆蓋基因組長(zhǎng)度655.2 cM?？偟恼f(shuō)來(lái)，由于普通蕎麥自交不親和，相關(guān)研究主要以蕎麥品種或品系為材料，主要運(yùn)用RAPD等標(biāo)記。

在重組自交系中，利用親本DNA樣品進(jìn)行RAPD 標(biāo)記引物篩選，并將重復(fù)性好的引物進(jìn)行其可育F2代分離群體樣本的PCR擴(kuò)增，用以分析甜蕎RAPD標(biāo)記多態(tài)性和構(gòu)建起分子遺傳連鎖圖譜。本研究對(duì)普通蕎麥重組自交系群體親本組合（Homo×甜自100，Lorena-3×甜自21-1）的親本用5種隨機(jī)引物的RAPD譜帶進(jìn)行多態(tài)性分析和指紋圖譜建立，以期為其F2代自交系群體的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。endprint

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

本研究選用了甜蕎重組自交系的4個(gè)親本甜蕎種，分別為L(zhǎng)orena-3、甜自21-1、甜自100和Homo。重組自交系的親本組合為：Homo×甜自100，Lorena-3×甜自21-1。甜蕎品種由貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心提供。

1.2 ?DNA提取

取2～3周苗齡的新鮮健康葉片約300 mg置于研缽中，倒入液氮，研成粉末。將該粉末直接轉(zhuǎn)入裝有預(yù)熱的含有15 μL β-巰基乙醇的1 000 μL 2% CTAB提取緩沖液（質(zhì)量濃度2% CTAB，100 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl，50 mmol/L EDTA-Na2，1.4 mol/L NaCl，質(zhì)量濃度2% PVP）的5 mL離心管中，輕輕搖動(dòng)使其充分混勻，置于65 ℃水浴中保溫60 min（每隔20 min輕輕顛倒混勻1次），加入酚/氯仿/異戊醇混合液（25∶24∶1，V/V/V），充分混勻，常溫下靜置10 min，10 000 r/min 離心10 min。將上清液加入氯仿/異戊醇混合液（24∶1，V/V），輕輕混勻，室溫下10 000 r/min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，加入2倍體積-20 ℃冰凍的無(wú)水乙醇，輕輕顛倒離心管直至出現(xiàn)白色絮狀沉淀，將離心管放在 ? ?-20 ℃中沉淀10 min。離心沉淀DNA并將沉淀用 -20 ℃冰凍的體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇洗滌兩次，在室溫下使DNA沉淀干燥。加入600 μL TE緩沖液，完全溶解后，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ?引物

共使用了5個(gè)隨機(jī)引物，各引物序列見(jiàn)表1。該引物從貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心設(shè)計(jì)的25個(gè)引物中選取，以親本間多態(tài)性好、電泳帶型清晰、重復(fù)性好為主要篩選原則。

1.4 ?PCR反應(yīng)體系

試驗(yàn)中，RAPD檢測(cè)使用的PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性10 min;94 ℃變性1 min，Tm（引物不同溫度不同）退火1 min，72 ℃延伸2 min，38個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.5 ?統(tǒng)計(jì)分析方法

擴(kuò)增產(chǎn)物于0.8%的瓊脂糖凝膠中電泳，在BioSenSC805型全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)的Analysis工具欄中，點(diǎn)擊消除背景圖標(biāo)以消除圖像本底的干擾;點(diǎn)擊自動(dòng)檢測(cè)所有泳道的條帶圖標(biāo)以進(jìn)行各泳道內(nèi)條帶檢測(cè);點(diǎn)擊相對(duì)分子質(zhì)量計(jì)算圖標(biāo)，以Marker泳道內(nèi)的Marker條帶的相對(duì)分子質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定相對(duì)分子量曲線圖，關(guān)閉Marker窗口，則會(huì)顯示各個(gè)條帶的相對(duì)分子質(zhì)量，統(tǒng)計(jì)各泳道內(nèi)的條帶數(shù)。

參考文獻(xiàn)[16]，采用條帶相似度系數(shù)分析條帶的多樣性。相似度系數(shù)SD=（2nAB）/（nA+nB），nA為A泳道內(nèi)的DNA條帶數(shù)，nB為B泳道內(nèi)的DNA條帶數(shù)，nAB是A、B泳道內(nèi)共有的條帶數(shù)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?親本甜蕎的RAPD電泳圖譜

不同引物擴(kuò)增的親本甜蕎的RAPD電泳圖譜如圖1和圖2所示。

2.2 ?親本甜蕎RAPD標(biāo)記的多樣性分析

根據(jù)篩選出的5個(gè)隨機(jī)引物的RAPD擴(kuò)增結(jié)果，可以對(duì)每對(duì)雜交組合中的兩個(gè)親本進(jìn)行擴(kuò)增條帶的多樣性分析，兩對(duì)雜交組合親本中各引物的擴(kuò)增情況與相似度系數(shù)見(jiàn)表3和表4。

由表3可知，對(duì)親本Homo（P1）×甜自100（P2）的組合進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，5個(gè)引物共擴(kuò)增出92條譜帶，平均每個(gè)隨機(jī)引物產(chǎn)生了18.4條譜帶。這些引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為17～20條譜帶，其中擴(kuò)增條帶數(shù)目最多的是引物R1182，共有20條譜帶;其次為引物R52和R428，均為19條譜帶;最少的為引物R41和R353，擴(kuò)增出17條譜帶。

對(duì)親本Homo（P1）×甜自100（P2）組合的所有隨機(jī)引物的RAPD標(biāo)記多樣性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（表3）表明，在5個(gè)隨機(jī)引物獲得的92條譜帶中，有18條譜帶在兩親本間表現(xiàn)為相同譜帶，RAPD標(biāo)記的相似度系數(shù)為39.13%（36/92）。對(duì)于每一條引物的相似度系數(shù)來(lái)說(shuō)，其變化范圍為31.58%（6/19）～50.00%（10/20）。其中RAPD標(biāo)記的相似度系數(shù)最高的引物是R1182，達(dá)到了50.00%，引物R428的標(biāo)記相似度系數(shù)最低，為31.58%（6/19）。因此，本研究所采用的雜交組合親本Homo（P1）×甜自100（P2）在基因組DNA水平上存在較低的RAPD標(biāo)記相似度系數(shù)，即DNA水平上條帶的多樣性較為豐富。有利于其子代群體獲得更為廣泛的性狀變異。

由表4可知，對(duì)親本Lorena-3（P1）×甜自21-1（P2）的組合進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，5個(gè)引物共擴(kuò)增出89條譜帶，平均每個(gè)隨機(jī)引物產(chǎn)生了17.8條譜帶。這些引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為15～20條譜帶，其中擴(kuò)增條帶數(shù)目最多的是引物R1182，共有20條譜帶;而后依次為R52、R353、R41、R428，擴(kuò)增出的譜帶數(shù)分別為19、18、17、15。

對(duì)Lorena-3（P1）×甜自21-1（P2）的親本組合所有隨機(jī)引物的RAPD標(biāo)記多樣性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（表4）表明，在5個(gè)隨機(jī)引物獲得的89條譜帶中，有51條譜帶在兩親本間的表現(xiàn)存在差異性，RAPD標(biāo)記的相似度系數(shù)為42.69%（38/89）。對(duì)每條引物的標(biāo)記相似度系數(shù)來(lái)說(shuō)，其變化范圍為40.0%（6/15）～47.06%（8/17）。其中RAPD標(biāo)記的相似度系數(shù)最低的引物為R428和R1182，相似度系數(shù)為40.00%，R41的標(biāo)記相似度系數(shù)最高，達(dá)47.06%（8/17）。因此，本研究所采用的雜交組合親本Lorena-3（P1）×甜自21-1（P2）基因組DNA水平上同樣存在較低的RAPD標(biāo)記相似度，也存在較高的多樣性，將有利于其子代群體獲得更為廣泛的性狀變異。endprint

2.3 ?親本甜蕎的RAPD指紋圖譜

根據(jù)全部隨機(jī)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，將能在親本組合中穩(wěn)定擴(kuò)增出現(xiàn)的、且具有差異的特異性譜帶用來(lái)構(gòu)建親本組內(nèi)P1和P2的RAPD標(biāo)記指紋圖譜。在Homo（P1）×甜自100（P2）的親本中，共擴(kuò)增出56條差異性譜帶（表5）;在Lorena-3（P1）×甜自21-1（P2）的親本中，共擴(kuò)增出51條差異性譜帶（表6）。

由表5和表6可知，Homo（P1）×甜自100（P2）和Lorena-3（P1）×甜自21-1（P2）組合親本RAPD指紋圖譜存在較明顯的差異性。前者中有28條譜帶為Homo（P1）所獨(dú)有，27條譜帶為甜自100（P2）所特有;后者中有24條譜帶為L(zhǎng)orena-3（P1）所獨(dú)有，24條譜帶為甜自21-1（P2）所特有。因此，在每對(duì)雜交組合中，存在差異的譜帶可看作是兩親本的特征性譜帶，而由RAPD指紋圖譜所反應(yīng)的這些特征譜帶可以作為鑒別親本的依據(jù)，也可為進(jìn)一步對(duì)雜交組合中親本的DNA多態(tài)性及其他分子遺傳研究打下基礎(chǔ)。

3 ?討論

Deng等[17]利用7個(gè)隨機(jī)引物對(duì)19個(gè)蕎麥（包括甜蕎和苦蕎）品種進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果表明其平均多態(tài)性達(dá)94.89%，而本研究結(jié)果表明，甜蕎重組自交系的兩對(duì)親本組合的平均相似度系數(shù)分別為39.13%（Homo×甜自100）和42.69%（Lorena-3×甜自21-1），再次在DNA水平上說(shuō)明蕎麥種間的多態(tài)性遠(yuǎn)高于種內(nèi)多態(tài)性。同時(shí)，對(duì)同屬甜蕎品種的兩個(gè)親本組合而言，其低于50%的相似度系數(shù)也從DNA的角度解釋了甜蕎異花授粉、自交不親和等生殖學(xué)特征所帶來(lái)的物種基因重組的多態(tài)性現(xiàn)象。在對(duì)蕎麥進(jìn)行種類(lèi)劃分的研究中，部分種類(lèi)難以從形態(tài)學(xué)上進(jìn)行識(shí)別，分類(lèi)特征也常存在較大變異，難以把握。本研究在DNA水平上進(jìn)行的RAPD遺傳標(biāo)記分析可對(duì)蕎麥品種鑒別和遺傳歧化研究提供依據(jù)。

此外，本研究以重組自交系親本為研究對(duì)象進(jìn)行RAPD分析，發(fā)現(xiàn)自交系群體親本之間存在較多的特異RAPD譜帶，也可為以重組自交系為研究對(duì)象進(jìn)行的相關(guān)農(nóng)藝學(xué)特征遺傳及分子標(biāo)記研究奠定基礎(chǔ)。

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