姚晶晶，多力坤

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

阿奇霉素與羅紅霉素對香煙煙霧提取物誘導A549細胞IL-8,IL-10和TGF-β1的影響

姚晶晶，多力坤

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

目的 探究阿奇霉素與羅紅霉素對香煙煙霧提取物(CSE)誘導A549細胞白細胞介素(IL)-8,IL-10和轉化生長因子-β1(TGF-β1)的影響。方法 實驗分為空白對照組(無血清的DMEM)、CSE組(濃度10%CSE)、10%CSE+阿奇霉素組(0.1 mg/mL阿奇霉素預處理2 h后加入濃度10%CSE)、10%CSE+羅紅霉素組(0.1 mg/mL羅紅霉素預處理2 h后加入濃度10%CSE)，將培養(yǎng)好A549細胞分別滴入上述培養(yǎng)皿，應用倒置顯微鏡觀察不同時間段細胞形態(tài)變化，酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測各組IL-8,IL-10和TGF-β1水平。結果CSE組IL-8及TGF-β1水平在9 h前呈增長趨勢,IL-10在3 h后逐漸降低。10%CSE+阿奇霉素組和10%CSE+羅紅霉素組IL-8及TGF-β1在3 h后均降低，且10%CSE+阿奇霉素組降低更明顯；在3 h后2組 IL-10水平均逐漸增高，但2組比較差異無統(tǒng)計學意義。空白對照組IL-8、IL-10及TGF-β1水平變化不明顯。結論 從抑制炎癥遞質失控性釋放的角度出發(fā)，推斷治療慢性肺部炎性疾病時，阿奇霉素較羅紅霉素效果顯著。

阿奇霉素；羅紅霉素；香煙煙霧提取物；白細胞介素-8；白細胞介素-10;轉化生長因子-β1

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是常見的慢性呼吸道疾病，近年來其患病率在全球范圍內有逐年增加的趨勢。臨床研究和實踐結果表明，規(guī)范化的診斷和治療，特別是實施有效的管理對提高哮喘的控制水平，改善患者生命質量具有十分重要的作用[1]。本研究擬用香煙煙霧提取物(CSE)誘發(fā)哮喘模型，觀察阿奇霉素、羅紅霉素對體外培養(yǎng)的肺泡Ⅱ型上皮細胞A549分泌白細胞介素(IL)-8,IL-10和轉化生長因子-β1(TGF-β1)的影響，旨在為阿奇霉素及羅紅霉素在哮喘防治中的作用提供初步的實驗依據(jù)。

1 實驗資料

1.1材料 肺泡Ⅱ型上皮細胞A549由中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫提供。

1.2實驗用試劑與儀器 儀器設備：CO2培養(yǎng)箱(Heal ForceHF240,香港),低速離心機(KDC-40),超凈工作臺(ZHJH-C11098),賽多利斯電子天平(BS2245),液氮生物容器(四川亞西牌),移液槍(全套),-20 ℃低溫冰柜(青島海爾),4 ℃冰箱(青島海爾),電熱恒溫干燥箱(DHG-9071A型),超純水儀(美國MilliQ公司),三用恒溫水浴箱(DK-600S,上海精宏實驗設備有限公司),系統(tǒng)提示顯微鏡,注射器,針頭。實驗用品:96孔培養(yǎng)皿(corning)，3.5 cm培養(yǎng)皿(corning)，6 cm培養(yǎng)皿(corning)，10 cm培養(yǎng)皿(corning)，5 mL移液管(FALCON)，10 mL移液管(FALCON)，15 mL塑料離心管(corning)，30 mL塑料離心管(corning)，50 mL塑料離心管(corning)，2 mL冷凍管(corning)，0.22 μm混合纖維素脂微孔濾膜(上海興亞凈化材料廠)，血球計數(shù)板，直頭玻璃吸管，燒杯，量杯，酒精燈，鋁制飯盒，貯槽，彎盤，10 mL玻璃皿，封口膜(parafilm)。主要試劑及藥品:兔抗人p65多克隆抗體，類胎牛血清(杭州四季青生物材料研究所)，DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)，PBS磷酸鹽緩沖液(北京中山生物技術有限公司)，胰蛋白酶(Gibco)，IL-10檢測試劑盒(Shanghai Joyee Biosource 公司,上海巧伊生物科技有限公司)，IL-8檢測試劑盒(Shanghai Joyee Biosource公司,上海巧伊生物科技有限公司)，TGF-β1檢測試劑盒(Shanghai Joyee Biosource公司,上海巧伊生物科技有限公司)，紅河香煙(云南紅河卷煙廠)，阿奇霉素(沈陽第一制藥廠，批號：141019)，羅紅霉素(湖南科倫制藥有限公司，批號：1208293B)。

1.3方法

1.3.1CSE的制備 將一根香煙用25 mL無血清的DMEM培養(yǎng)液制成懸液，密封瓶內，搖動使其充分溶解，調pH至7.3，過濾除菌，配置成含10% CSE，于1 h內用于實驗。

1.3.2分組 培養(yǎng)皿注藥分為空白對照組(無血清的DMEM)、CSE組(濃度10%CSE)、10%CSE+阿奇霉素組(0.1 mg/mL阿奇霉素預處理2 h后加入濃度10%CSE)、10%CSE+羅紅霉素組(0.1 mg/mL羅紅霉素預處理2 h后加入濃度10%CSE)。

1.3.3細胞分離及培養(yǎng) 首先將含有肺泡Ⅱ型上皮細胞A549的凍存管從液氮中小心取出，立即輕輕投入預先準備好的37 ℃溫水中，遠離面部。輕輕順時針搖動使冷凍管內容物盡快融化，直到凍存管中剩少許冰晶，將凍存管從37 ℃水浴中取出，用乙醇擦拭消毒凍存管，置于離心機，2 000 r/min離心5 min，紫外線提前20～30 min打開，于超凈工作臺內開啟，去除上清液，用1 mL吸管吸出冷凍細胞，輕輕滴入10 cm培養(yǎng)皿中，均勻滴入10 mL培養(yǎng)液(細胞培養(yǎng)液為含有10%加熱滅活胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μL/mL鏈霉素的DMEM)。顯微鏡下觀察各濃度下細胞生長狀況(數(shù)量、形態(tài)、透亮度、貼壁情況)；用乙醇棉對培養(yǎng)瓶外部進行擦拭。將培養(yǎng)基倒掉，加PBS磷酸鹽緩沖液沖洗一下，如不需傳代，加入5 mL新鮮培養(yǎng)基即可；傳代：加1 mL PBS磷酸鹽緩沖液反復沖洗一下(快速)，加入1 mL左右胰蛋白酶，37 ℃ 1 min，輕敲瓶壁使大部分細胞脫落，倒置顯微鏡觀察，細胞脫落，加入3 mL培養(yǎng)基(DMEM)終止消化；用吸管反復輕柔吹打，盡量讓細胞均勻分散開來，置入離心管中 ，2 000 r/min離心5 min,離心后，去上清液，加入3n(n為傳代瓶數(shù))mL培養(yǎng)基(DMEM)，各取出3 mL至新瓶中；放入CO2培養(yǎng)箱(培養(yǎng)條件5% CO2、飽和濕度、37 ℃)。

1.3.4指標檢測 將培養(yǎng)細胞分別滴入分好組的培養(yǎng)皿中，應用倒置顯微鏡于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h觀察各組的細胞形態(tài)變化，收集細胞上清液，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測IL-8,IL-10和TGF-β1的變化。按照試劑盒說明進行步驟。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1各組肺泡Ⅱ型上皮細胞A549形態(tài)比較 9 h時倒置顯微鏡下觀察：空白對照組細胞形態(tài)呈橢圓形或梭形， 細胞輪廓清楚，細胞間結構緊密，見圖1；10%CSE組細胞邊緣不規(guī)則,胞體和胞核結構不清，有偽足伸出，胞漿內有顆粒狀物質，細胞間接觸變松，見圖2； 10%CSE+阿奇霉素組細胞輪廓較CSE組清楚,與空白對照組變化不明顯，見圖3；10%CSE+羅紅霉素組細胞輪廓、胞體和胞核結構介于空白對照組和CSE組細胞之間，見圖4。

2.2不同時間段IL-8水平比較 10%CSE組IL-8水平在9 h前呈增長趨勢；10%CSE+阿奇霉素組和10%CSE+羅紅霉素組IL-8水平在3 h后降低，10%CSE+阿奇霉素組較10%CSE+羅紅霉素組降低更明顯；空白對照組各時間段IL-8水平比較差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

圖1 空白對照組細胞形態(tài)(DAB×400)

圖2 10%CSE組細胞形態(tài)(DAB×400)

圖3 10%CSE+阿奇霉素組細胞形態(tài)(DAB×400)

圖4 10%CSE+羅紅霉素組細胞形態(tài)(DAB×400)

表1 各組上清液IL-8水平比較

2.3不同時間段IL-10水平比較 10%CSE組IL-10水平在3 h后逐漸降低；10%CSE+阿奇霉素組和10%CSE+羅紅霉素組IL-10水平在3 h后逐漸增加，2組比較差異無統(tǒng)計學意義；空白對照組各時間段IL-10水平比較差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

2.4不同時間段TGF-β1水平比較 10%CSE組TGF-β1水平在9 h前呈增長趨勢；10%CSE+阿奇霉素組和10%CSE+羅紅霉素組TGF-β1水平在3 h后降低，且10%CSE+阿奇霉素組較10%CSE+羅紅霉素組降低更明顯；空白對照組各時間段TGF-β1水平比較差異無統(tǒng)計學意義。見表3。

表2 各組上清液IL-10水平比較

表3 各組上清液TGF-β1水平比較

3 討 論

哮喘是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞和T淋巴細胞等多種炎性細胞參與的氣道慢性炎癥，這種氣道炎癥使易感者對于各種激發(fā)因子具有氣道反應性，并引起氣道縮窄，表現(xiàn)為反復發(fā)作性的喘息、呼吸困難、胸悶或咳嗽等癥狀[2]，常在夜間和/或清晨發(fā)作、加劇。目前哮喘已成為全球關注的公共衛(wèi)生問題，影響不同年齡組的人群，尤其是兒童哮喘已成為兒童最常見的慢性呼吸道疾病[3]，嚴重影響兒童的身體健康和生長發(fā)育。

哮喘的發(fā)病與多種遞質有關，如血小板活化因子(PAF)、前列腺素、血栓素、白三烯、組胺、腺苷等，其中PAF對嗜酸性細胞有強烈的趨化作用，從而引起呼吸道嗜酸性粒細胞的浸潤活化，相繼引起氣道上皮損傷[4-5]。目前研究認為，哮喘的炎癥反應主要是由于Th1/Th2失衡，抗原刺激使Th0向Th1或Th2的分化所致。Th1主要合成釋放IL-2和IFN-γ，促進細胞免疫，調節(jié)免疫抗感染的功能，Th2則主要生成IL-4，IL-5，IL-10，IL-13等[6-7]。一般認為IFN-γ和IL-4，IL-5分別為Th1和Th2特征性細胞因子，IFN-γ可以促進Th0向Th1分化，促進嗜酸性細胞凋亡；而IL-4則促進Th0向Th2分化，誘發(fā)哮喘癥狀加重。

IL-8又稱嗜中性粒細胞因子，是炎癥性疾病的重要遞質，在抗感染、免疫反應調節(jié)以及抗腫瘤方面有重要作用[8]。IL-8對特異性和非特異性的免疫細胞具有強烈的趨化作用，其中主要是對嗜中性粒細胞的趨化和激活作用，對淋巴細胞和嗜堿性粒細胞也有趨化作用[9]。作為一種主要的炎癥因子，IL-8水平在感染及某些自身免疫性疾病的情況下在炎癥局部、血清和體液中均有顯著增加，如肺纖維化、呼吸窘迫綜合征、慢性支氣管炎、支氣管擴張等。

TGF-β1是一種多功能的細胞因子，是由2條分子量為11 kD有112個氨基酸構成的單鏈通過二硫鍵結合而成的分子量為25 kD的多肽[10]。它在細胞的生長、分化、免疫調節(jié)、調節(jié)細胞外基質合成及損傷后的修復方面發(fā)揮著重要的作用[11-12]。其具有抗炎和促炎雙重作用，還有獨特的促纖維化作用，參與哮喘氣道炎癥、免疫應答[13]及氣道重塑，與哮喘的關系十分密切。TGF-β1對間充質起源的細胞起刺激作用，而對上皮或神經外胚層來源的細胞起抑制作用[14]。支氣管哮喘是以氣道高反應性和不可逆性氣道重塑為特點的氣道慢性炎癥性疾病，而氣道重塑一旦形成很難逆轉，因此哮喘非常難治[15]。

本研究結果顯示，CSE可導致肺泡Ⅱ型上皮細胞的形態(tài)結構變化，促使IL-8，TGF-β1分泌，抑制IL-10分泌，因而可以促進炎癥反應，導致氣道重塑。阿奇霉素和羅紅霉素可抑制IL-8及TGF-β1分泌，增加IL-10分泌，從而減輕使肺組織炎癥程度，可阻止或減輕氣道重塑，且阿奇霉素作用明顯優(yōu)于羅紅霉素。提示對于合并氣道重塑呼吸道疾病如支氣管哮喘、肺纖維化、呼吸窘迫綜合征、慢性支氣管炎、支氣管擴張等的治療，阿奇霉素療效比羅紅霉素更為顯著。

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Effects of azithromycin, erythromycin on the activity of IL-8,IL-10 and TGF-β1in A549 cells induced by cigarette smoke extraction

YAO Jingjing, DUO Likun

(The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang, China)

Objective It is to study the effect of azithromycin, erythromycin on IL-10, IL-8, TGF - β1 secretion in A549 cells induced by cigarette smoke extraction(CSE). Methods The A549 cells cultivated in vitro were divided into 4 groups: blank control group without serum DMEM, CSE group given 10% CSE, 10% CSE+azithromycin group given 10%CSE in 2 h after preconditioning with 0.1 mg/mL azithromycin, 10% CSE+erythromycin group given 10%CSE in 2 h after preconditioning with 0.1 mg/mL erythromycin, then the cellular morphological changes were observed under inverted microscope, and the levels of IL-8, IL-10 and TGF-β1were determined by ELISA. Results In CSE group the levels of IL-8 and TGF- β1showed a increasing trend within 9 h, while that of IL-10 decreased gradually after 3 h. In 10% CSE+azithromycin group and 10% CSE+erythromycin group, the levels of IL-8 and TGF- β1both decreased and the level of IL-10 increased in 3 hours later, but the decrease was more significantly in CSE+azithromycin group, while the difference in increase was not significant between the two groups. The changes of IL-8, IL-10 and TGF- β1were not significant in blank control group. Conclusion From the perspective of inhibition of sexual release inflammatory mediators, concluded that for the treatment of chronic pulmonary inflammatory diseases, azithromycin erythromycin effect is more remarkable.

azithromycin; erythromycin; cigarette smoke extract; IL-10; IL-8; TGF - β1

姚晶晶，女,碩士研究生，主治醫(yī)師,研究方向為呼吸系統(tǒng)疾病。

多力坤，E-mail:docdlk@tom.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.07.008

R-33

A

1008-8849(2015)07-0706-04

2014-10-15