陳　晶

(解放軍白求恩國際和平醫(yī)院 檢驗實驗科, 河北 石家莊, 050082)

重組融合蛋白早期快速診斷侵襲性念珠菌病的實驗研究

陳晶

(解放軍白求恩國際和平醫(yī)院 檢驗實驗科, 河北 石家莊, 050082)

摘要:目的建立一種IC早期快速準(zhǔn)確的診斷方法。方法178例臨床需要送檢侵襲性念珠菌病常規(guī)檢測和真菌培養(yǎng)的患者血清為研究對象，其中103例確診為侵襲性念珠菌病者作為病例組，75例為在同樣免疫妥協(xié)易感人群但無念珠菌感染微生物學(xué)證據(jù)的患者血清作為對照組。應(yīng)用基因重組的方法，將念珠菌菌絲壁蛋白(HWP1)，與位于細(xì)胞壁的糖酵解酶(烯醇化酶蛋白ENO1)進行基因克隆，隨后將由HWP1與ENO1組成的重組蛋白在大腸桿菌中表達，并建立酶聯(lián)免疫方法(ELISA), 檢測患者血清中的IgG特異性抗體。通過統(tǒng)計學(xué)的分析，計算出該方法的靈敏度，特異性，陽性預(yù)測值，陰性預(yù)測值。篩選出靈敏度高，特異性強，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值均高的融合蛋白抗原建立的ELISA方法。結(jié)果病例組中抗-ENO1、抗-HWP1以及二者聯(lián)合檢測的陽性檢出率均顯著高于對照組(P<0.01), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。抗-HWP1與抗-ENO1兩方法相比，抗-HWP1的敏感性(χ2=37.622,P<0.01)、陽預(yù)測值(χ2=74.427,P<0.01)及陰性預(yù)測值(χ2=2.057,P=0.152)均顯著高于抗-ENO1; 聯(lián)合檢測與抗-ENO1比較，敏感性(χ2=44.524,P<0.01)、特異性(χ2=9.765,P=0.002)及陽預(yù)測值(χ2=72.000,P<0.01)均顯著高于抗-ENO1; 聯(lián)合檢測與抗-HWP1相比，特異性(χ2=4.700,P=0.030)、陰性預(yù)測值(χ2=3.191,P=0.074)顯著高于抗-HWP1。結(jié)論ENO1和HWP1蛋白重組后聯(lián)合診斷的效果更佳，可以作為IC早期快速準(zhǔn)確的診斷方法。

關(guān)鍵詞:侵襲性念珠菌病; HWP1; ENO1; 重組蛋白; 實驗室診斷

由真菌感染引起的發(fā)病近些年來在全世界不斷上升，尤其在免疫力受損的人群中表現(xiàn)更為突出，如免疫力低下的患者、器官移植失敗以及晚期腫瘤病人等繼發(fā)性感染大部分均是由真菌感染所引起。侵襲性念珠菌病(IC)已居于血液中分離的病原菌感染的第4位，又以白念珠菌為常見[1-3]。據(jù)統(tǒng)計念珠菌菌血癥若得不到及時有效的治療，有高達46%～76%的死亡率[4]。診斷真菌感染的主要依據(jù)是醫(yī)學(xué)真菌學(xué)檢查，而早期特異性診斷在指導(dǎo)臨床及時準(zhǔn)確使用抗真菌藥物中發(fā)揮重要作用，是挽救真菌感染患者生命的關(guān)鍵。近年來，抗原重組融合蛋白技術(shù)的發(fā)展給我們提供良好的實驗條件，本研究中作者將菌絲細(xì)胞壁的蛋白(HWP1)與烯醇化酶(ENO1)的蛋白基因進行融合，通過原核表達融合蛋白，建立ELISA方法檢測血清抗體，以提高其敏感性和特異性，以期其綜合性能優(yōu)于單一抗體的檢測，達到早期快速而準(zhǔn)確地診斷IC的目的。

1資料與方法

1.1　樣本來源

血清樣本來源于本院2013年7月—2015年3月留取的178例臨床需要送檢侵襲性念珠菌病常規(guī)檢測和真菌培養(yǎng)的患者的血清。其中103份血清檢驗確診為侵襲性念珠菌病，作為病例組；另外75份血清為在同樣免疫妥協(xié)易感人群但無念珠菌感染微生物學(xué)證據(jù)的患者血清，作為對照組。

1.2　儀器與試劑

白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株購于中國微生物所菌種保藏管理委員會微生物中心; pQE-30表達載體和大腸埃希菌BL21(DE3)來自本實驗室; His-Tag小鼠單克隆抗體; DNA提取、DNA片段質(zhì)粒提取和純化試劑盒; 溶細(xì)胞酶(1yticase); 限制性內(nèi)切酶Nde I及BamH I; T4連接酶等均購于美國Sigma公司。

1.3　重組融合蛋白的制備和鑒定

1.3.1分別構(gòu)建HWP1、ENO1原核表達質(zhì)粒并誘導(dǎo)、純化蛋白：根據(jù)文獻報道和GENEBANK，設(shè)計HWP1與ENO1的基因引物，引物部分是由Invitrogen公司代為合成的。 RT-PCR法克隆各自的全基因序列，分別與pQE-30載體連接，酶切鑒定后獲得HWP1與ENO1兩種蛋白的原核表達質(zhì)粒；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達融合蛋白，Western Blot鑒定，獲得純化蛋白。

1.3.2構(gòu)建HWP1與ENO1連接的原核表達質(zhì)粒并誘導(dǎo)、純化蛋白：重疊PCR將HWP1基因與ENO1基因連接在一起后，構(gòu)建成原核表達質(zhì)粒，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達融合蛋白，Western Blot鑒定，并獲得融合的純化蛋白。

1.4　HWP1與ENO1的檢測

采用間接ELISA法測定患者血樣中抗-HWP1和抗-ENO1，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。分別以單獨一種蛋白和組合的蛋白包被ELISA板，檢測相應(yīng)抗體IgG。檢測血液等無菌體液證明的IC患者血清抗體，比較分析融合蛋白和單一蛋白的靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值，確定ELISA方法。

1.5　統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 19.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理；行χ2檢驗；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1　抗-HWP1、抗-ENO1以及兩種聯(lián)合檢測的診斷結(jié)果

病例組中抗-ENO1陽性17例，檢出陽性率為16.5%, 相比對照組的5.3%的陽性檢出率而言，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.023)。病例組中抗-HWP1的陽性檢出率為65%(67例)，與對照組的2.7%的陽性檢出率相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。病例組中抗-ENO1與抗-HWP1聯(lián)合檢測出陽性88例，檢出率為65%，顯著高于對照組的1.3%的檢出率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 見表1。

表1　抗-HWP1、抗-ENO1以及兩種聯(lián)合檢測的診斷結(jié)果[n(%)]

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2　抗-HWP1和抗-ENO1以及兩種方法聯(lián)合檢測診斷性能比較

本次研究中，檢測 ENO1和 HWP1抗體的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值詳見表2。對這三種檢測方法進行統(tǒng)計學(xué)分析，抗- HWP1與抗-ENO1兩方法相比，抗-HWP1的敏感性(χ2=37.622,P<0.01)、陽預(yù)測值(χ2=74.427,P<0.01)及陰性預(yù)測值(χ2=2.057,P=0.152)均顯著高于抗-ENO1，而特異性(χ2=1.008,P=0.315)無顯著差異。聯(lián)合檢測與抗-ENO1比較，敏感性(χ2=44.524，P<0.01)、特異性(χ2=9.765,P=0.002)及陽預(yù)測值(χ2=72.000，P<0.01)均顯著高于抗-ENO1, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，陰性預(yù)測值(χ2=0.148,P=0.700)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。聯(lián)合檢測與抗-HWP1相比，特異性(χ2=4.700,P=0.030)、陰性預(yù)測值(χ2=3.191,P=0.074)顯著高于抗-HWP1，而敏感性(χ2=0.479,P=0.489)和陽預(yù)測值(χ2=0.032,P=0.858)無顯著差異。

表2　抗-HWP1和抗-ENO1以及兩種方法聯(lián)合檢測

3討論

念珠菌病是由念珠菌屬真菌所引起的一種常見的條件致病菌，通?？稍谄つw、黏膜，甚至內(nèi)臟和各個系統(tǒng)器官與宿主共存，當(dāng)機體免疫力低下或內(nèi)環(huán)境失調(diào)時造成嚴(yán)重感染，是目前發(fā)病率最高的深部真菌病[5]。近年來，IC感染的發(fā)病率及死亡率顯著上升。目前，中國念珠菌病的發(fā)生率在0.71‰～0.85‰, 對人們的健康已造成嚴(yán)重的危害[6]。

鏡檢、真菌培養(yǎng)及組織病理學(xué)是診斷真菌實驗室的常規(guī)檢查方法。直接鏡檢簡便、實用，但陽性率低，且陰性結(jié)果也不能排除診斷。培養(yǎng)檢查可提高病原菌檢出陽性率同時確定致病菌種類，還可做體外藥敏試驗。但鑒定菌種需結(jié)合菌落特征、生化試驗等，耗時長。并且在正常有菌標(biāo)本中檢出念珠菌的陽性預(yù)測值也不高。組織病理學(xué)檢查對深部真菌感染至關(guān)重要，在組織切片中找到病原真菌是確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”[7-8]。然而僅一次切片未必一定能找到真菌，且深部真菌感染易造成各種組織反應(yīng)，也會對診斷產(chǎn)生很大困難。而且組織病理學(xué)檢查需要侵入性操作，本身就可能帶來比較嚴(yán)重的并發(fā)癥如出血、感染等，增加了操作的危險性。因此, 傳統(tǒng)方法雖然簡單實用，然而其具有耗時長、敏感性低、特異性差等缺點，不能很好地對臨床早期IC進行特異性診斷。目前真菌感染早期診斷的研究已聚焦于抗原及抗體的檢測方法。

目前已得到研究者廣泛驗證的潛在診斷IC的標(biāo)志物，主要包括核酸檢測、(1, 3)β-D 葡聚糖、甘露聚糖等細(xì)胞壁類成分, D-阿拉伯糖醇等代謝產(chǎn)物，分泌性天冬氨酸酶(SAP)、烯醇化酶(ENO1)等抗原成分，但在臨床實踐中還沒有一個得以已廣泛接受和應(yīng)用[9-10]。單就(1, 3)β-D 葡聚糖檢測而言，目前已有商品檢測試劑盒，該方法敏感度達1 ng/L, 但存在假陽性，所以該方法只能作為系統(tǒng)真菌病的診斷篩查試驗。最近有關(guān)侵襲性念珠菌感染患者血清抗體的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多個抗體組合比單一抗體對IC的預(yù)測價值高，且血清抗體IgG反應(yīng)優(yōu)于IgM。因此，檢測念珠菌多種血清抗體可提高診斷IC的敏感率。但其檢測方法如果應(yīng)用于臨床實驗室常規(guī)檢測，存在檢測項目多的缺陷。

細(xì)胞壁成分如(1, 3)β-D葡聚糖、甘露聚糖，

抗原成分如分泌性天冬氨酸酶(SAP)以及存在于念珠菌細(xì)胞內(nèi)的烯醇化酶(ENO1)等標(biāo)志物已成為目前對侵襲性念珠菌病進行早期診斷的研究熱點[11]。許多研究[12-13]表明，單一額抗體對侵襲性念珠菌病的早期診斷的敏感性、特異性仍偏低。然而抗原重組融合蛋白技術(shù)給我們提供良好的實驗條件。本研究中，作者將菌絲細(xì)胞壁的蛋白HWP1與烯醇化酶(ENO1)的基因進行融合，通過原核表達融合蛋白，建立ELISA方法檢測血清抗體，以提高其敏感性和特異性。實驗結(jié)果表明，抗-HWP1、抗-ENO1以及兩種聯(lián)合檢測三種方法均具有診斷意義；且聯(lián)合檢測的敏感性、特異性及陽預(yù)測值均顯著高于抗-ENO1(P<0.01); 特異性、陰性預(yù)測值顯著高于抗-HWP1(P<0.01), 而敏感性和陽性預(yù)測值與抗-HWP1相當(dāng)(P>0.05); 檢測效果排序為聯(lián)合檢測優(yōu)于HWP1檢測，優(yōu)于ENO1檢測。說明兩種蛋白重組后聯(lián)合診斷的效果更佳，可以作為IC早期快速準(zhǔn)確的診斷方法。

參考文獻

[1]郭鳳梅, 楊毅, 邱海波. 中國重癥患者侵襲性念珠菌感染的流行病學(xué)特征[J]. 中華內(nèi)科雜志, 2014, 53(6): 491.

[2]Pitarch A, Nombela C, Gil C. Serum Antibody Signature Directed against Candida albicans Hsp90 and Enolase Detects Invasive Candidiasis in Non-Neutropenic Patients[J]. Journal of proteome research, 2014, 13(11): 5165.

[3]孔小祥, 李芳秋, 王仕欽, 等. 抗烯醇化酶抗體檢測對侵襲性念珠菌病的診斷價值[J]. 臨床檢驗雜志, 2011, 29(6): 413.

[4]Fortún J, Meije Y, Buitrago M J, et al. Clinical validation of a multiplex real-time PCR assay for detection of invasive candidiasis in intensive care unit patients[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2014, 69(11): 3134.

[5]賀政新, 陳晶, 冉向陽, 等. 白念珠菌磷酸甘油酸激酶 1 的原核表達及免疫原性分析[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2013, 29(10): 1079.

[6]Delaloye J, Calandra T. Invasive candidiasis as a cause of sepsis in the critically ill patient[J]. Virulence, 2014, 5(1): 161.

[7]馬春芳, 陸靜芬, 孔倩倩, 等. 念珠菌優(yōu)勢抗體檢測方法的建立及臨床診斷價值評估[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報, 2013, 26(11): 1138.

[8]Farooqi J Q, Jabeen K, Saeed N, et al. Invasive candidiasis in Pakistan: clinical characteristics, species distribution and antifungal susceptibility[J]. Journal of medical microbiology, 2013, 62(Pt 2): 259.

[9]Flevari A, Theodorakopoulou M, Velegraki A, et al. Treatment of invasive candidiasis in the elderly: a review[J]. Clinical interventions in aging, 2013, 8: 1199.

[10]陸靜芬. 用重組抗原診斷侵襲性念珠菌病[J]. 臨床檢驗雜志, 2012, 30(3): 213.

[11]Orsi C F, Borghi E, Colombari B, et al. Impact of Candida albicans hyphal wall protein 1 (HWP1) genotype on biofilm production and fungal susceptibility to microglial cells[J]. Microbial pathogenesis, 2014, 69: 20.

[12]李芳秋, 胡毓安, 史利寧, 等. 侵襲性念珠菌病患者抗烯醇化酶抗體水平升降及影響因素[J]. 臨床檢驗雜志, 2014, 32(11): 817.

[13]饒志剛, 趙子文. 真菌抗原檢測在侵襲性肺真菌病診斷中的價值[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2012, 33(21): 3273.

Research on recombinant fusion protein in early

fast diagnosis of invasive candidiasis

CHEN Jing

(DepartmentofClinicalLaboratory,BethuneInternationalPeaceHospitalofPLA,

Shijiazhuang,Hebei, 050082)

ABSTRACT:ObjectiveTo establish a early fast diagnostic method for invasive candidiasis.MethodsA total of 178 patients′ serums demanding laboratory detection of invasive candidiasis and fungus culture were selected as the research objects, among which 103 serum samples diagnosed invasive candidiasis were included in the disease group and another 75 serum samples in the immunocompromised susceptible population but without monilial infection were as the control group. Candida albicans hyphal wall protein (HWP1) and glycolytic enzyme (enolase protein ENO1) located in the cell wall were cloned by gene recombination, and the recombinant protein composed of HWP1 and ENO1 were expressed in Escherichia coli. Further more, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was established to detect specificity antibodies of IgG in the serum of the patients. Statistical analysis was used to calculate the sensitivity, specificity, positive prediction value, and negative prediction value. Meanwhile, the fusion protein antigen with higher sensitivity, specificity, positive prediction value and negative prediction value was screened. ResultsThe positive detection rates of anti -ENO1, anti -HWP1 and combined detection were significantly higher than that in control group, the difference was statistically significant(P<0.01). Comparison of Anti-HWP1 and anti-ENO1 showed that the sensitivity of anti-HWP1 (χ2=37.622,P<0.01), positive predictive value (χ2=74.427,P<0.01) and negative predictive value (χ2=2.057,P=0.152) were significantly higher than that of anti-ENO1. The sensitivity(χ2=44.524,P<0.01) and specific of (χ2=9.765,P=0.002) and positive predictive value (χ2=72.000,P<0.01 of joint detection were significantly higher than that anti-ENO1. The specificity (χ2=4.700,P=0.030) and negative predictive value (χ2=3.191,P=0.074) of joint detection was significantly higher than that of anti-HWP1. ConclusionJoint diagnosis has better efficacy after recombinant protein of ENO1 and HWP1 protein, and it can be used as a rapid and accurate method for early diagnosis of IC.

KEYWORDS:invasive candidiasis; HWP1; ENO1; recombinant protein; laboratory diagnosis

基金項目:河北省自然科學(xué)基金項目(C2010001882)

收稿日期:2015-04-20

中圖分類號:R 519.3

文獻標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)15-055-03

DOI:10.7619/jcmp.201515016