李錦松，陳劍鴻，孟民杰　(.廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 50006；.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所藥學(xué)部，重慶 40004)

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金絲桃苷對低壓低氧時(shí)大鼠認(rèn)知功能損傷的改善作用

李錦松1，陳劍鴻2，孟民杰1(1.廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所藥學(xué)部，重慶 400042)

[摘要]目的研究金絲桃苷(Hyperoside，Hyp)對低壓低氧誘導(dǎo)大鼠認(rèn)知功能損傷的預(yù)防作用。方法將大鼠分為空白組與用藥組，空白組分為平原空白組和高原空白組，用藥組分為平原Hyp低、中、高劑量組(10 mg/kg,20 mg/kg,40 mg/kg)和高原Hyp低、中、高劑量組(10 mg/kg,20 mg/kg,40 mg/kg)。高原各組置入模擬海拔6 100 m低壓艙內(nèi)7 d，平原各組置于常氧環(huán)境飼養(yǎng)，利用Morris水迷宮觀察Hyp對大鼠認(rèn)知功能損傷的影響；檢測大鼠海馬組織中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)的活性、以及丙二醇(malondialdehyde,MDA)和還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)的含量變化。結(jié)果低壓低氧暴露后大鼠在目標(biāo)象限的時(shí)間、距離和經(jīng)過平臺(tái)的次數(shù)均顯著減少(P<0.05或P<0.01)；Hyp治療組顯著削弱這一效應(yīng)，相對低氧組，大鼠在目標(biāo)象限的時(shí)間、距離以及經(jīng)過平臺(tái)的次數(shù)均顯著提升(P<0.05或P<0.01)。Hyp治療組海馬組織中的SOD、CAT的活性和GSH含量均顯著升高，MDA水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論Hyp對低壓低氧引起的記憶損傷具有預(yù)防作用，其機(jī)制可能是通過上調(diào)SOD、CAT等蛋白的抗氧化活性，減輕低氧引起的氧化應(yīng)激損傷。

[關(guān)鍵詞]金絲桃苷；低壓低氧；認(rèn)知功能；抗氧化活性

大腦的正常運(yùn)轉(zhuǎn)大約需要機(jī)體20%的氧氣，因此中樞神經(jīng)系統(tǒng)對低壓低氧環(huán)境尤其敏感[1]。研究表明，長期或者短期暴露于低壓低氧環(huán)境中，都能夠引起大鼠海馬組織的氧化應(yīng)激損傷從而導(dǎo)致記憶損傷[2-4]。金絲桃苷(Hyperoside，Hyp)又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，是一種從天然植物中提取的黃酮醇苷類化合物，具有抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡和抗抑郁等廣泛的藥理學(xué)活性[5-8]。我們前期研究證實(shí)了Hyp以濃度劑量方式改善了過氧化氫、四氯化碳等引起的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[9-10]，但是關(guān)于Hyp對于低壓低氧引起的氧化應(yīng)激損傷的防治作用未見報(bào)道。本文利用低壓艙模擬高原環(huán)境，建立低壓低氧引起大鼠氧化應(yīng)激而導(dǎo)致認(rèn)知功能損傷模型，觀察不同劑量的Hyp對于大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并探究其可能的抗氧化機(jī)制。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

高原低壓環(huán)境模擬艙(第三軍醫(yī)大學(xué)高原醫(yī)學(xué)系與中國貴航集團(tuán)風(fēng)雷軍械廠聯(lián)合研制)；Morris水迷宮(上海移數(shù)信息科技有限公司)；Synergy HT多功能酶標(biāo)儀(美國 Bio-TEK)；Hyp(濃度為98%，分子式C21H20O12,相對分子質(zhì)量為463.3，批號(hào)ZL130306582，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫(CAT)，丙二醇(MDA)以及還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2大鼠空間認(rèn)知訓(xùn)練

健康SD雄性大鼠80只，5到7周齡，體質(zhì)量(220±20) g，購于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證證號(hào):SYXK(渝)2007-0002。參考Morris等[11]所示的方法進(jìn)行，略有改進(jìn)。動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1 d后，進(jìn)行Morris定位航行實(shí)驗(yàn)。大鼠在開始訓(xùn)練前取出平臺(tái)在水中適應(yīng)15 s，每次實(shí)驗(yàn)將大鼠從4個(gè)不同象限頭朝池壁放入Morris水迷宮的水池中，次序隨機(jī)，連續(xù)訓(xùn)練8 d，每天4次，記錄大鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期。如果時(shí)間超過60 s大鼠未尋找到平臺(tái)，則引導(dǎo)大鼠至平臺(tái)并停留15 s，每次試驗(yàn)結(jié)束后用毛巾擦干放進(jìn)籠中。第9天(低氧暴露前)進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)、在目標(biāo)象限停留的時(shí)間和距離。定位航行與空間探索實(shí)驗(yàn)過程保持實(shí)驗(yàn)室燈光和環(huán)境布局不變。當(dāng)大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)、在目標(biāo)象限停留的時(shí)間和距離等指標(biāo)顯示獲得較為一致的空間認(rèn)知(記憶)后，進(jìn)行隨后的實(shí)驗(yàn)。

1.3給藥與缺氧

大鼠獲得空間認(rèn)知后，隨機(jī)分組，分別按低(10 mg/kg)、中(20 mg/kg)、高(40 mg/kg)3種單次給藥量，將Hyp溶解于生理鹽水中，按1 mL/kg腹腔給藥，1 h后，將動(dòng)物放置于模擬海拔6 100 m的低壓艙飼養(yǎng)(高原給藥組)，置平原飼養(yǎng)者作為平原給藥組。自由飲食和水。每天給藥1次，連續(xù)7 d。

1.4記憶能力檢測

低壓艙內(nèi)低壓低氧8 d后，采用Morris水迷宮法。按照1.2所述方法，進(jìn)行水迷宮空間探索性實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間，停留距離和穿越平臺(tái)次數(shù)。

1.5海馬組織氧化應(yīng)激損傷水平檢測

大鼠進(jìn)行空間探索性實(shí)驗(yàn)后，用13%烏拉坦深度麻醉，迅速取腦(15 s內(nèi))，放置于已在冰上遇冷的錫箔紙上，手術(shù)刀片將大腦分成左右半腦，剝離海馬組織，用預(yù)冷的0.9%生理鹽水清洗后干凈濾紙吸干，放入凍存管，液氮保存。第2天取出配置10%海馬組織勻漿，3 000 r/min，4 ℃，離心10 min，取上清分裝，放置-80 ℃冰箱，取適量組織勻漿測定MDA和GSH含量，MDA測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法，GSH含量測定采用二硫代二硝基笨甲酸(DTNB)法，具體操作和計(jì)算按說明書進(jìn)行。

1.6海馬抗氧化酶活性檢測

同上取材，SOD活性測定采用通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下顯紫紅色。CAT活性測定采用CAT分解過氧化氫(H2O2)的反應(yīng)可通過加入鉬酸胺而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸胺作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，在405 nm處測定其生產(chǎn)量，具有操作和計(jì)算按說明書進(jìn)行。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1Hyp對低壓低氧大鼠認(rèn)知損傷的改善作用

Morris水迷宮定位航行訓(xùn)練第1～8天的潛伏期分別為(51.4±1.0) s、(44.9±1.0) s、(30.9±3.6) s,(23.8±2.8) s、(20.1±1.6) s、(17.2±0.7) s,(13.5±1.8) s、(10.9±0.5) s。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著訓(xùn)練天數(shù)的延長大鼠達(dá)到平臺(tái)的潛伏期逐漸減少，大鼠經(jīng)過8 d水迷宮訓(xùn)練后獲得了平臺(tái)位置的空間記憶。大鼠低壓低氧前空間探索性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠在目標(biāo)象限(Ⅰ象限)所停留時(shí)間和距離顯著比其他象限的延長(P<0.01)，即大鼠在原平臺(tái)所在的象限(Ⅰ象限)停留時(shí)間和距離分別為(23.2±1.7) s和(535.5±35.8) cm，而在Ⅱ象限，Ⅲ象限，Ⅳ象限停留時(shí)間和距離分別為(12.9±0.8) s和(337.0±18.6) cm,(11.9±0.6)s和(315.1±27.8)cm和(11.3±1.8) s和(291.0±52.9) cm。

經(jīng)過模擬6 100 m海拔，連續(xù)7 d低壓低氧后，高原空白組(未用藥組)大鼠在目標(biāo)象限時(shí)間所待的時(shí)間、距離和經(jīng)過平臺(tái)次數(shù)與平原空白組(未用藥組)相比均顯著減少(P<0.05或P<0.01)。而與高原空白相比，Hyp高原用藥中劑量和高劑量組在目標(biāo)象限所待時(shí)間、距離和經(jīng)過平臺(tái)次數(shù)顯著增加(P<0.05)，Hyp高原用藥低劑量組在目標(biāo)象限所待距離和經(jīng)過平臺(tái)次數(shù)也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見表1。然而，在平原Hyp用藥組與平原空白組之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1　Hyp對低氧大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

#：與高原空白組比較，P<0.05; *：與高原空白組比較，P<0.01；△：與平原空白組比較，P<0.05；▲:與平原空白組比較，P<0.01

2.2Hyp對海馬組織氧化應(yīng)激損傷的改善作用

與平原空白組相比，高原空白組海馬勻漿組織中MDA顯著增加，見圖1a，。而高原給藥各組(Hyp 10 mg/kg,20 mg/kg,40 mg/kg)的MDA含量顯著低于高原空白對照組(P<0.05或P<0.01)，并具有劑量依賴關(guān)系。GSH含量是組織內(nèi)氧化還原狀態(tài)的另一重要指標(biāo)，與平原空白組相比，高原空白組海馬組織中GSH的含量顯著減少(P<0.05)，見圖1b。高原用藥組(Hyp 20 mg/kg、40 mg/kg)的GSH含量顯著高于高原空白組(P<0.05)。

2.3Hyp對海馬組織抗氧化蛋白活性的影響

與平原空白組相比，高原空白組海馬組織中GSH的含量和CAT、SOD活性顯著減少(P<0.01)。高原治療組(10 mg/kg,20 mg/kg,40 mg/kg)均能顯著增強(qiáng)SOD和CAT的活性(P<0.05或P<0.01)，并具有劑量依賴關(guān)系，見圖2a、b。

圖1Hyp對低氧大鼠海馬組織MDA和GSH的影響

圖2Hyp對低氧大鼠海馬組織CAT和SOD活性的影響

3討論

在高海拔地區(qū)氧分壓下降導(dǎo)致機(jī)體組織中可用的氧減少，在全身各器官和組織的代謝反應(yīng)中，腦組織主要以高耗氧的有氧代謝為主，并且組織代謝率可變動(dòng)范圍很窄，腦細(xì)胞對低氧尤其敏感[1]。高原低壓低氧環(huán)境使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，會(huì)使機(jī)體內(nèi)自由基增多，實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)了急性高原暴露后導(dǎo)致全腦內(nèi)自由基增多[12]。體內(nèi)如果不能及時(shí)處理過多自由基，就會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。

Morris水迷宮是一種常用的檢測動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)通常分成為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索性實(shí)驗(yàn)兩部分。定位航行實(shí)驗(yàn)是訓(xùn)練大鼠獲得空間學(xué)習(xí)記憶的過程，空間探索性實(shí)驗(yàn)是測驗(yàn)大鼠對已獲得的空間學(xué)習(xí)記憶的提取、判斷、重現(xiàn)的過程。大鼠進(jìn)行低壓低氧暴露后，空間探索性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對于平原空白組，高原空白組的大鼠在原平臺(tái)象限的滯留時(shí)間、距離和穿過平臺(tái)的次數(shù)等指標(biāo)均顯著下降，表明低壓低氧影響了大鼠在定位航行實(shí)驗(yàn)中已獲得的學(xué)習(xí)記憶的提取過程，從而顯著降低了大鼠在空間探索性實(shí)驗(yàn)中對學(xué)習(xí)記憶的重現(xiàn)過程。這實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了低壓低氧對大鼠學(xué)習(xí)記憶的功能造成了損傷，同時(shí)國外其他研究也證實(shí)了相類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[13-14]。

高原組用Hyp處理后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠顯著提高了在原平臺(tái)象限滯留時(shí)間滯留時(shí)間、距離和穿過平臺(tái)的次數(shù)。然而在平原給予Hyp處理后，與平原空白相比，其并沒有顯著提高平原大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。高原組的低壓低氧導(dǎo)致大鼠大腦產(chǎn)生氧化應(yīng)激，從而影響大鼠的學(xué)習(xí)記憶的重現(xiàn)，Hyp給藥后顯著削弱了低壓低氧引起學(xué)習(xí)記憶損傷，并呈劑量依賴性。由于平原組并沒有產(chǎn)生氧化應(yīng)激，Hyp并沒有產(chǎn)生這種作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了Hyp具有抗低壓低氧損傷效應(yīng)。

大腦海馬組織在學(xué)習(xí)記憶的過程中發(fā)揮著重要的作用，因此我們從大鼠大腦中分離海馬組織，檢測了其氧化應(yīng)激水平和抗氧化應(yīng)激能力。丙二醇(MDA)是膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其水平反映氧化應(yīng)激損傷程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高原空白組的海馬組織中MDA含量顯著高于平原空白組，表明低壓低氧引起了海馬組織氧化應(yīng)激損傷。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，Hyp用藥組較未用藥MDA含量顯著降低，說明用藥后大鼠海馬組織脂質(zhì)過氧化損傷得到明顯改善，Hyp發(fā)揮了抗氧化損傷的作用。

還原型谷胱甘肽(GSH)是機(jī)體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物，是一種低分子清除劑，可清除機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的過氧化氫(H2O2)，因而GSH量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低壓低氧能導(dǎo)致大鼠海馬組織內(nèi)的GSH含量顯著下降，然而在低壓低氧下給予Hyp后，其可提高海馬組織內(nèi)GSH含量，以中劑量組(20 mg/kg)的效果最佳。超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫(CAT)是機(jī)體內(nèi)2種重要的抗氧化應(yīng)激蛋白酶，SOD能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損失；CAT可清除機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生H2O2。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低壓低氧后大鼠海馬組織中的SOD和CAT的活性顯著降低，而低壓低氧給藥后，海馬組織中的SOD和CAT活性顯著提高，并呈一定劑量依賴型關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明Hyp能增強(qiáng)抗氧化蛋白的活性，促進(jìn)海馬組織啟動(dòng)抗氧化機(jī)制，發(fā)揮抗氧化作用。

綜上所述，Hyp具有減輕低壓低氧認(rèn)知功能損傷的作用，其機(jī)理可能是降低大鼠海馬組織低氧時(shí)的MDA水平，提高GSH含量，并增強(qiáng)SOD和CAT等抗氧化酶的活性，從而減輕低氧導(dǎo)致的海馬組織的氧化應(yīng)激損傷。本研究提示，Hyp有望成為預(yù)防低氧引起的氧化應(yīng)激損傷，提升高原腦力勞動(dòng)能力的有效藥物。

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(編輯：魏源)

Hyperoside attenuated hypoxia-induced memory impairment by antioxidative activity

LI Jin-song1,CHEN Jian-hong2,MENG Min-jie1(1.College of Life Science and Biopharmaceutical,Guandong Pharmaceutical University,Guangzhou Guangdong 510006,China;2.Department of Pharmacy,Daping Hosipital and Research Institute of Surgery,Third Military Medical University,Chongqing 400042,China)

Abstract:ObjectiveTo determine the effects of Hyperoside (Hyp) on the memory impairment induced by hypobaric hypoxia. MethodsSD rats were exposed in hypobaric hypoxia chamber which simulated 6 100 m high altitude for 7 days to induce memory impairment.Morris maze was applied to determine the effects of Hyp on memory in hypobaric chamber.The activities of SOD and CAT and levels of GSH and MDA in rat hippocampus were measured by assay kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute).ResultsIn target quadrant,the time and path and the frequency to cross platform were reduced under hypobaric hypoxia as compared with normoxia group(P<0.05 orP<0.01).Administration of Hyp significantly attenuated the hypoxia-induced the memory impairment responses(P<0.05 orP<0.01).The activities of SOD and CAT in rats hippocampus exposed to hypobaric hypoxia were significantly improved in the presence of Hyp as compared with the absence of Hyp(P<0.05 orP<0.01),so did GSH level (P<0.05 orP<0.01). Significant decrease of MDA levels was observed in the hippocampus on exposure to hypobaric hypoxia with Hyp as compared without Hyp. ConclusionHyp reduces hypoxia-induced oxidative stress injury by upregulating activity of antioxidant proteins such as SOD,CAT in hippocampus of rats, which contribute to attenuate memory impairment induced by hypobaric hypoxia.

Keywords:hyperoside;hypobaric hypoxia;memory;antioxidant activity

[收稿日期]2014-11-12[修回日期] 2014-12-17

[通訊作者]孟民杰,E-mail:mminjie@163.com;陳劍鴻，E-mail:chenjh-110@263.net

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金(81273608)

doi:10.11659/jjssx.11E014043

[中圖分類號(hào)]R285.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1672-5042(2015)02-0181-04