王瑞瑞（青海師范大學(xué)，青海西寧810008）

水解膠原蛋白的制備方法與應(yīng)用進(jìn)展

王瑞瑞
（青海師范大學(xué)，青海西寧810008）

摘要：水解膠原蛋白具有優(yōu)異的營(yíng)養(yǎng)特性和加工特性。介紹了制備水解膠原蛋白的酶法工藝過(guò)程及使用的水解酶的種類，詳細(xì)說(shuō)明了水解膠原蛋白的食用功能、醫(yī)用功能、美容功能和工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。最后，立足青海的豐富資源和產(chǎn)業(yè)特點(diǎn)，對(duì)水解膠原蛋白的開(kāi)發(fā)前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：水解膠原蛋白；酶解；制備；應(yīng)用

膠原蛋白是多細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)普遍存在的一種蛋白質(zhì)，是皮膚、肌腱、韌帶、血管、骨骼、軟骨等組織形成和再生的關(guān)鍵物質(zhì)。其分子是由三個(gè)α-肽鏈互相擰成的三股螺旋結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，分子中的每個(gè)肽鏈上約含有1 200個(gè)氨基酸，還含有獨(dú)特的羥脯氨酸，相對(duì)分子質(zhì)量約為290 kDa，進(jìn)入人體后很難被吸收利用。水解膠原蛋白是膠原蛋白水解的產(chǎn)物。水解使膠原蛋白的多肽鍵被打斷，從而使溶解度差、不易被機(jī)體吸收的大分子膠原蛋白轉(zhuǎn)化為水溶性好、易于被機(jī)體吸收的小分子多肽（相對(duì)分子質(zhì)量約3 000 Da）。水解膠原蛋白的蛋白質(zhì)含量高達(dá)92%以上，富含人體所需要的18種氨基酸和多種微量元素。其中，丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸的含量都很高[1]。水解膠原蛋白還具有膠體保護(hù)性、表面活性、保水性、黏結(jié)性、乳化性等多種特征，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

1　水解膠原蛋白的原料

制備水解膠原蛋白的原料一般為動(dòng)物的皮膚和肌腱組織[2]，主要來(lái)源于牛、羊、豬、雞。近年來(lái)研究熱點(diǎn)主要集中于以低成本的牲畜雜骨、臟器、水產(chǎn)品的邊角料和廢鉻屑等工業(yè)廢棄物，如雞骨、牛骨、魚骨、魚皮、魚鱗、豬皮等為原料生產(chǎn)水解膠原蛋白。利用天然動(dòng)物材料生產(chǎn)有用的生物化學(xué)產(chǎn)品，不但可以變廢為寶，提高經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也為廢棄物的再利用開(kāi)辟了新途徑。

2　水解膠原蛋白的制備工藝

膠原蛋白是一種多糖蛋白，它含有少量的半乳糖和葡萄糖，具有很強(qiáng)的延伸力和力學(xué)強(qiáng)度，不溶于水[3]。生產(chǎn)水解膠原蛋白通?？刹捎没瘜W(xué)降解法和酶降解法?；瘜W(xué)降解法是利用酸、堿水解膠原蛋白。在酸的作用下，膠原分子間的鹽鍵和Schiff堿被破壞，從而引起膠原纖維膨脹、溶解，因此，可以采用0.5 mol/L的乙酸、檸檬酸或鹽酸在pH 2～3提取膠原[4]。但是，此條件不能使膠原全部水解，膠原蛋白的水解率低。在堿的作用下，膠原肽鍵極易發(fā)生水解，含羥基、巰基的氨基酸會(huì)全部被破壞?；瘜W(xué)降解法雖然方法簡(jiǎn)單、廉價(jià)，但是由于生產(chǎn)過(guò)程中氨基酸的受損嚴(yán)重，如：酸水解法會(huì)使色氨酸、絲氨酸受到破壞，而且很難精確控制水解程度；堿水解法往往會(huì)引起氨基酸的外消旋作用，產(chǎn)生D、L-型氨基酸消旋混合物，若D-型氨基酸含量大于L-型氨基酸，則會(huì)抑制L-型氨基酸的吸收，有些D-型氨基酸甚至有害，因此，化學(xué)降解法已逐步被淘汰。酶降解法條件溫和，不會(huì)破壞氨基酸的成分，氨基酸的構(gòu)型不會(huì)發(fā)生改變，并且可以精確控制水解程度。此法能耗低，有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是目前生產(chǎn)水解膠原蛋白最有效的方法。

酶解法制備水解膠原蛋白的工藝流程如下：

原料→預(yù)處理→酶水解→滅酶→脫苦、脫腥→過(guò)濾→濃縮、干燥→成品

2.1水解酶的種類

催化膠原蛋白水解的酶種類很多，主要有膠原酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等。動(dòng)物膠原酶能在生理pH值及溫度條件下水解天然膠原纖維，作用位點(diǎn)在第775與776位氨基酸之間，因?yàn)槿鄙賮啺被?，三股螺旋結(jié)構(gòu)較松散，使其在離氨基端3/4處斷裂成兩部分，使膠原纖維喪失其穩(wěn)定的三維螺旋結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到溶解膠原蛋白的最終目的[5]。

細(xì)菌膠原酶可以從肽鏈的兩端逐步把膠原水解至Gly-X-Y的三肽，而且細(xì)菌膠原酶的活性可以不受金屬蛋白酶組織抑制劑的影響。胰蛋白酶是一種肽鏈內(nèi)斷酶，作用于由堿性氨基酸殘基和羧基組成的肽鍵；對(duì)賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鏈，具有選擇性水解作用；對(duì)天然膠原的首次水解位置在精氨酸-甘氨酸連接的肽鍵（即780-781）處，可把天然蛋白、變性蛋白、纖維蛋白和粘蛋白等蛋白質(zhì)水解為多肽或氨基酸。由于血清中含有非特異性胰蛋白酶抑制劑，使胰蛋白酶不會(huì)消化正常組織。糜蛋白酶又叫胰凝乳蛋白酶，是一種肽鏈內(nèi)斷酶，主要作用于由芳香族氨基酸殘基的羧基組成的肽鍵，選擇在酪氨酸和苯丙氨酸羧肽鏈處作用，比胰蛋白酶的能力強(qiáng)，毒性低，副作用小。胃蛋白酶主要作用于膠原纖維兩端非螺旋區(qū)的球蛋白結(jié)構(gòu)。膠原纖維內(nèi)分子間的共價(jià)交聯(lián)是由分子末端賴氨酸或羥賴氨酸形成，用胃蛋白酶切斷末端交聯(lián)結(jié)構(gòu)，使膠原分子的巨形結(jié)構(gòu)被破壞，從而可提取各種類型的膠原。木瓜蛋白酶的切割分解點(diǎn)很多，優(yōu)先分解精氨酸、苯丙氨酸的肽鍵。

2.2一步酶解法

一步酶解法是指用一種酶水解或多種酶同時(shí)水解的方法。汪濤[6]以扇貝加工廢棄物—扇貝邊為原料，扇貝邊解凍后，去雜質(zhì)，用高速組織搗碎機(jī)搗碎，采用枯草桿菌蛋白酶、胰蛋白酶進(jìn)行深度水解；酶解完畢立即終止反應(yīng)和滅菌，冷卻至室溫，在轉(zhuǎn)速為4 500 r/min下離心10 min，所得清液即為水解液。得到的產(chǎn)品的粗蛋白含量為66.88%，氨基酸態(tài)氮含量為6.96%。賴海濤等[7]以烤鰻下腳料（包括鰻頭、鰻骨）為原料，取一定數(shù)量，剁碎，用組織搗碎機(jī)搗成漿狀，調(diào)固液比及pH值，加2.0%的枯草桿菌中性蛋白酶，50℃，pH7.5，水解5 h，反應(yīng)完成后用

沸水浴加熱10 min，使酶失活，經(jīng)離心過(guò)濾得魚蛋白水解液。此方法能充分利用水產(chǎn)廢棄物。趙勝年[4]以新鮮豬皮為原料，清洗去污后，加熱脫脂，然后進(jìn)行高壓蒸煮（0.15 MPa、15 min），之后將熟豬皮和湯移入反應(yīng)罐內(nèi)，然后加入0.01～0.02的胰酶，pH 值8～9，水解2～3 h，酶解反應(yīng)結(jié)束后升溫將酶滅活，分離去渣，即得反應(yīng)清液，經(jīng)濃縮后噴霧干燥制成粉劑，其總蛋白質(zhì)提取率高于80%。李帆等[8]以牦牛骨為原料，脫脂、脫鹽后用木瓜蛋白酶進(jìn)行水解，最佳的工藝條件為：酶解溫度60℃，酶解時(shí)間8 h，酶用量3 500 U/g蛋白質(zhì)，料液比1∶25（g/mL）。該研究結(jié)果為青藏高原牦牛骨資源的高值轉(zhuǎn)化利用提供了重要的參考數(shù)據(jù)。

2.3多步酶解法

袁永俊等[9]以動(dòng)物肉（市售牛肉、雞、魚）為原料，經(jīng)清洗、去脂肪，肉骨分離后，肉與水的比例為1∶3，用組織勻漿機(jī)打漿。料漿加熱至80℃，恒溫30 min，使蛋白質(zhì)適度變性，之后用膠體磨處理，再采用胰蛋白酶和中性蛋白酶水解，先用2%的胰酶45℃，pH8.0水解3 h，再用3%的中性蛋白酶50℃，pH7.5水解2 h。水解后，加熱至80℃滅酶5 min，然后用沉降式離心機(jī)離心沉降10 min（轉(zhuǎn)速為5 000 r/min），沉淀部分與骨頭一起水解。上層清液直接經(jīng)真空濃縮、干燥、粉碎后，得到水解膠原蛋白。

多步酶解法制得的水解液一般有苦味和腥臭味?？辔段镔|(zhì)的化學(xué)成分主要是水解液的一些短肽，它們具有大體積的疏水側(cè)鏈。風(fēng)味酶和羧肽酶A能水解這些側(cè)鏈，不僅能除去苦味，還能增加游離氨基酸的含量，因而是一種理想的脫苦劑。多步酶解法條件溫和、操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低、生產(chǎn)周期短，可以廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)類物質(zhì)水解膠原蛋白的制造工藝中[10]。

3　水解膠原蛋白的功能

3.1食用功能

水解膠原蛋白富含人體所需要的18種氨基酸和多種微量元素，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和實(shí)用功能。一方面，水解膠原蛋白具有良好的表面活性，可以作為功能性食品添加劑或調(diào)味料，提高食品的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值。宋永等[11]通過(guò)蛋糕焙烤和灌腸加工實(shí)驗(yàn)，研究了魚鱗水解膠原蛋白在蛋糕和灌腸中的應(yīng)用效果，表明適量添加魚鱗水解膠原蛋白可以提高蛋糕的成品率和蛋糕的比容，增加灌腸制品的成品率，提高灌腸的持水力，可以使蛋糕內(nèi)部結(jié)構(gòu)細(xì)膩、松軟有彈性、口感滋潤(rùn)爽口，從而能獲得感官品質(zhì)良好的蛋糕和灌腸制品。另一方面，水解膠原蛋白還可以作為乳化劑和穩(wěn)定劑添加到冰激凌和雪糕中，賦予產(chǎn)品優(yōu)異的穩(wěn)定效果，使產(chǎn)品在低脂肪下可達(dá)到高奶油口感的效果。乳制品富含蛋白質(zhì)、維他命（包括維他命D）和礦物質(zhì)，具有改善人體健康狀況及降低患病風(fēng)險(xiǎn)的作用。水解膠原蛋白由于分子量低，無(wú)脂、無(wú)糖、無(wú)添加，易溶解，耐高溫，適用pH值范圍廣，配伍性強(qiáng)，再加上獨(dú)特的生物功能和較高的消化性、吸收性，可廣泛用于鮮奶、酸奶、乳飲料、奶粉等乳制品中[12]。在歐美和日本，在乳制品中添加水解膠原蛋白已經(jīng)成為一項(xiàng)慣用做法。此外，水解膠原蛋白還可用于生物發(fā)酵培養(yǎng)基，也可以作為一種高蛋白飼料營(yíng)養(yǎng)添加劑替代進(jìn)口魚粉用于混配飼料生產(chǎn)[13]。

總之，在食品中添加水解膠原蛋白既提高了產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，又增強(qiáng)了產(chǎn)品的保健功能。目前，許多企業(yè)都以添加水解膠原蛋白來(lái)提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)值及附加值。今后，水解膠原蛋白類保健食品將會(huì)有很大的市場(chǎng)發(fā)展前景。

3.2醫(yī)用功能

水解膠原蛋白具有治療骨質(zhì)疏松、促進(jìn)糖尿病恢復(fù)、降低血壓、降低血液總膽固醇、保護(hù)胃粘膜、抗?jié)兊葼I(yíng)養(yǎng)及生理功能[14]，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的一個(gè)新方向。一方面，水解膠原蛋白中富含氨基酸以及肌肉和骨骼成長(zhǎng)所必需的物質(zhì)，人體通過(guò)補(bǔ)充水解膠原蛋白，能有效地促進(jìn)骨的形成，預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，有助于塑造結(jié)實(shí)的體格。相關(guān)研究證明[15]，水解膠

原蛋白在軟骨細(xì)胞中會(huì)大量產(chǎn)生II型膠原蛋白和蛋白糖，這兩種物質(zhì)是形成新的軟骨組織和修復(fù)受損軟骨組織的關(guān)鍵物質(zhì)。在軟骨承受正常壓力的情況下，由于軟骨細(xì)胞活動(dòng)的刺激性效果，能夠形成由反饋機(jī)制控制下的軟骨微創(chuàng)自愈過(guò)程，在軟骨上或者軟骨內(nèi)生成大量的小分子量膠原蛋白片斷。因此，可以有效地緩解關(guān)節(jié)炎的疼痛，改善骨關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)靈活性，減少鎮(zhèn)痛劑的用量。另一方面，水解膠原蛋白可以用作治療缺鈣癥的激活劑，對(duì)彌補(bǔ)兒童期、青春期缺鈣有顯著的療效，高純度的水解膠原蛋白能夠治療由于缺鈣引起的早期骨質(zhì)疏松癥。

此外，水解膠原蛋白具有抑制血壓上升的功能。李娜等[16]以豬全股骨、股骨干、股骨頭膠原蛋白水解產(chǎn)物為樣品，研究其對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）血壓的影響。結(jié)果表明：以豬股骨的各部位為原料酶解制備的膠原多肽具有較強(qiáng)的體外ACE抑制活性，股骨是ACE抑制肽的良好來(lái)源，在20～60 mg／mL的范圍內(nèi)，只有較高質(zhì)量濃度的豬股骨頭膠原蛋白水解產(chǎn)物能顯著降低SHR的血壓。

3.3美容功能

膠原蛋白經(jīng)酶解后形成水解膠原蛋白，會(huì)造成肽鍵的斷裂，導(dǎo)致一些極性親水基團(tuán)（如—COOH、—NH2、—OH）數(shù)目的增加，大量親水基團(tuán)外露，導(dǎo)致水解膠原蛋白的吸水性、水溶性和保水性明顯增加。水解膠原蛋白還含有高劑量的甘氨酸、羥脯氨酸、脯氨酸、丙氨酸，導(dǎo)致其吸水性和保水性更強(qiáng)[17]。

一方面，水解膠原蛋白能刺激皮膚的纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，顯著增加膠原纖維的細(xì)胞密度、直徑，使皮膚的力學(xué)強(qiáng)度增加，柔軟度和彈性增加，保濕能力增強(qiáng)，皮膚細(xì)小皺紋和深層皺紋得到改善，從而起到抗老化、防皺紋、美容、養(yǎng)顏，增強(qiáng)皮膚細(xì)胞再生，回復(fù)肌膚彈性的作用。很多臨床研究也證實(shí)了水解膠原蛋白的美容功效。周建烈等[18]報(bào)道了Peptan水解膠原蛋白、純I型膠原蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量在2 000～5 000 Da，含有9種必需氨基酸中的8種，其中甘氨酸、羥脯氨酸／脯氨酸和谷氨酸含量非常高，占氨基酸總量的50%以上。經(jīng)國(guó)際皮膚健康研究組織鑒定和臨床研究顯示：每日口服Peptan水解膠原蛋白可以有效滋潤(rùn)皮膚，減少因皮膚干燥缺水引起的其他皮膚問(wèn)題，增加肌膚柔軟度、彈性和肌膚明亮度，而且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何不良反應(yīng)，Peptan水解膠原蛋白還具有保護(hù)關(guān)節(jié)、骨骼健康和減肥的新功能。

另一方面，水解膠原蛋白不僅可以用來(lái)滋養(yǎng)皮膚、毛發(fā)、指甲和全身的結(jié)締組織，同時(shí)可以幫助受損的肌膚恢復(fù)正常外觀，如：加速青春痘、痘疤等傷口的愈合。近年來(lái)，隨著水解膠原蛋白提取技術(shù)的逐漸成熟，人們對(duì)水解膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)等做了深入研究，水解膠原蛋白的美容功能已經(jīng)得到了廣泛認(rèn)同，在“以內(nèi)養(yǎng)外”美容觀念的驅(qū)使下，口服水解膠原蛋白液作為新型美容保養(yǎng)品已成為市場(chǎng)熱點(diǎn)。

3.4工業(yè)價(jià)值

我國(guó)皮革工業(yè)每年產(chǎn)生數(shù)量眾多的固體廢棄物，主要包括廢毛、皮屑、削勻革屑、修邊料、廢二層等，含有優(yōu)質(zhì)的天然膠原蛋白資源[19]。這些水解膠原蛋白雖然不能直接食用，但可以作為制備表面活性劑的原料。

秦樹(shù)法等[20]以皮革工業(yè)廢棄物中提取的水解膠原蛋白為原料，制備了多肽酰胺表面活性劑，在優(yōu)化合成條件（V月桂酰氯∶V復(fù)合多肽液∶V丙酮= 1∶2∶2，pH值10，常溫）下制備的多肽酰胺兩性表面活性劑具有良好的生理活性，可應(yīng)用于護(hù)發(fā)用品、化妝品、食品、農(nóng)藥等方面。此方法既充分利用了天然膠原蛋白資源，制備了新型的表面活性劑，又減輕了皮革固體廢棄物的污染。強(qiáng)濤濤等[21]研究了用戊二醛作為交聯(lián)劑，以水解膠原蛋白為改性劑，對(duì)超細(xì)纖維合成革基布進(jìn)行改性研究，最佳改性工藝條件為：水解膠原蛋白用量為15%，戊二醛用量為8%，改性溫度為35℃，改性時(shí)間為5 h，體系pH值為7.0。在此改性條件下，超細(xì)纖維合成革基布的表面纖維束的松散程度增大，表面的活性基團(tuán)增加，與染料的結(jié)合點(diǎn)增多，從而透水汽性和吸濕性以及上染率得到顯著提高，基布顏色明顯增深，耐干濕擦

牢度提高。充分利用制革工業(yè)廢棄物生產(chǎn)低鉻或無(wú)鉻的水解膠原蛋白產(chǎn)品并進(jìn)行工業(yè)應(yīng)用，符合我國(guó)固體廢棄物資源化、無(wú)害化的政策要求。

4　展望

酶解法制備的水解膠原蛋白既可以作為功能添加劑廣泛用于制作各類營(yíng)養(yǎng)食品、乳制品及各類化妝品的配料，也可以單獨(dú)作為口服保健產(chǎn)品。這些水解膠原蛋白都是從天然動(dòng)物材料中提取出來(lái)的，一方面，利用天然的動(dòng)物材料生產(chǎn)有用的生物化學(xué)產(chǎn)品，在提高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的同時(shí)也為動(dòng)物資源的深加工開(kāi)辟了新途徑。以青海為例，牦牛作為青海省的特色物種之一，牦牛肉、奶制品的加工是民族地區(qū)的特色產(chǎn)業(yè)。牦牛生長(zhǎng)在高海拔地區(qū)，特殊的生態(tài)環(huán)境使牦牛體內(nèi)富含高營(yíng)養(yǎng)、高功能的有機(jī)成分。目前，青海以牦牛產(chǎn)業(yè)的邊角料（牦牛皮、牦牛骨）為原料提取水解膠原蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，牦牛水解膠原蛋白具有更為優(yōu)異的補(bǔ)血、活血、抗衰老等功效，已應(yīng)用于臨床[22]。同時(shí)，開(kāi)發(fā)利用牦牛水解膠原蛋白，將有利于促進(jìn)西部民族地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。另一方面，水解膠原蛋白通過(guò)改性以后作為表面活性劑應(yīng)用于皮革、紡織、造紙等行業(yè)，具有廣闊的市場(chǎng)發(fā)展前景?？傊饽z原蛋白的廣泛利用，為廢棄物的再利用開(kāi)辟了新的途徑，符合綠色無(wú)害化的清潔生產(chǎn)理念。

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更正啟事

發(fā)表在我刊2015年18期39頁(yè)《制革污泥處理及資源化利用研究進(jìn)展》一文的基金項(xiàng)目應(yīng)為：國(guó)家自然科學(xué)基金（21376258），特此更正。

Progress in Preparation Methods and Application of Hydrolyzed Collagen Protein

WANG Rui-rui
(Department of Chemistry, Qinghai normal university, Xining 810008, China)

Abstract:Hydrolyzed collagen protein has good nutritional property and processing property. It was introduced that the process using hydrolytic enzyme for preparing hydrolyzed collagen protein and the types of utilizing hydrolytic enzymes. Then edibility, medicine and grooming functions and industrial application value of hydrolyzed collagen protein was described in detail. Finally, on the basis of productive resources and industrial characteristics in Qinghai, the application prospect of hydrolyzed collagen protein was looked forward to.

Key words:hydrolyzed collagen; enzymolysis; preparation; application

作者簡(jiǎn)介：王瑞瑞（1980-）女，甘肅白銀人，碩士，青海師范大學(xué)化學(xué)系副教授，主要從事皮革化學(xué)品方面的研究。E -mail：wangruirui206@163.com。

收稿日期：2015-09-08

中圖分類號(hào)：TS 512

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671-1602（2015）20-0021-05