王冰冰, 曲來葉, 馬克明, 張心昱, 宋成軍

1 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域國家重點(diǎn)實(shí)驗室, 北京 100085 2 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049 3 中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所生態(tài)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)觀測與模擬重點(diǎn)實(shí)驗, 北京 100101 4 農(nóng)業(yè)部規(guī)劃設(shè)計研究院, 北京 100125

岷江上游干旱河谷優(yōu)勢灌叢群落土壤生態(tài)酶化學(xué)計量特征

王冰冰1,2, 曲來葉1,*, 馬克明1, 張心昱3, 宋成軍4

1 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域國家重點(diǎn)實(shí)驗室, 北京 100085 2 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049 3 中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所生態(tài)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)觀測與模擬重點(diǎn)實(shí)驗, 北京 100101 4 農(nóng)業(yè)部規(guī)劃設(shè)計研究院, 北京 100125

與碳(C)、氮(N)和磷(P)分解礦化相關(guān)的土壤生態(tài)酶的相對活性可以揭示微生物生長和代謝過程的能量限制。盡管干旱生態(tài)系統(tǒng)愈來愈受到生態(tài)學(xué)家的關(guān)注，但在土壤水分有效性限制和斑塊狀分布的植被背景下，探討土壤酶活性化學(xué)計量特征，及其與土壤物理、化學(xué)因子和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系的相關(guān)研究仍十分缺乏。通過調(diào)查岷江干旱河谷不同水分梯度4個研究樣地(兩河口、飛虹、撮箕和牟托)灌叢及其叢間空地的土壤物理化學(xué)性質(zhì)、微生物群落組成和土壤生態(tài)酶活性，探討不同水分梯度樣地間及灌叢和空地間土壤酶活性計量的分布特征。結(jié)果顯示，岷江干旱河谷土壤C∶N∶P酶活性化學(xué)計量表現(xiàn)出了與全球尺度上酶活性化學(xué)計量的相對特異性(C∶N∶P = 3∶2∶2 vs. 1∶1∶1)。整體上，岷江干旱河谷區(qū)域土壤微生物生長代謝存在一定程度的N限制。雖然酶活性化學(xué)計量特征在所有空地和灌叢土壤之間總體未表現(xiàn)出顯著差異，但對各研究地的進(jìn)一步分析表明，兩個相對干旱的兩河口和飛虹樣地表現(xiàn)出更為明顯的N限制，而兩個相對濕潤的撮箕和牟托樣地則存在一定的P限制。這種樣地間的差異性主要受土壤水分有效性的驅(qū)動。逐步回歸分析表明，土壤含水量是不同樣地間土壤C∶N酶活性比(ln(BG)∶ln(NAG+LAP))和N∶P酶活性比(ln(NAG+LAP)∶ln(AP))的決定性影響因子。而土壤含水量與C∶N酶活性比具有顯著正相關(guān)關(guān)系，與N∶P酶活性比表現(xiàn)為顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。此外，土壤真菌、菌根真菌和真菌∶細(xì)菌比對土壤酶活性化學(xué)計量的影響，說明了真菌和菌根真菌類群對干旱河谷養(yǎng)分循環(huán)的重要作用。

岷江; 干旱河谷; 生態(tài)酶化學(xué)計量; 養(yǎng)分有效性; 土壤含水量

土壤微生物對土壤有機(jī)質(zhì)的分解，以及對C、N、P等養(yǎng)分元素的吸收利用受到環(huán)境中的土壤胞外酶的調(diào)節(jié)[1]。多數(shù)胞外酶通過微生物響應(yīng)環(huán)境條件的變化而被表達(dá)、釋放到土壤中，另一些則是通過細(xì)胞溶解進(jìn)入土壤[1]。目前研究最多的土壤胞外酶包括：降解纖維素的β-1,4-葡萄糖苷酶 (β-1,4-glucosidase, BG)；降解幾丁質(zhì)和肽聚糖的β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶 (β-1,4-N-acetylglucosaminidase, NAG)；水解蛋白質(zhì)和多肽的亮氨酸氨基肽酶 (leucine aminopeptidase, LAP)；礦化有機(jī)磷的酸性(或堿性)磷酸酶 (acid or alkaline phosphatase, AP)。在生態(tài)學(xué)研究中，這些胞外酶的活性與微生物代謝、養(yǎng)分的生物化學(xué)循環(huán)密切相關(guān)。不同酶活性的比值，如BG∶(NAG+LAP)、BG∶AP和(NAG+LAP)∶AP常與養(yǎng)分濃度或者C∶N、C∶P和N∶P的比值相聯(lián)系，并用來評價微生物C、N、P養(yǎng)分資源需求狀況[2-4]。Sinsabaugh 等因此提出了生態(tài)酶活性化學(xué)計量(Ecoenzymatic stoichiometry)概念[5]。

理論和實(shí)踐工作表明，土壤生態(tài)酶的相對活性與資源的有效性相耦合。生態(tài)經(jīng)濟(jì)學(xué)的“最優(yōu)配置”模型建立在酶的生產(chǎn)對養(yǎng)分資源有效性敏感的假設(shè)基礎(chǔ)上，這使得微生物可以將更多的目標(biāo)放在那些最需求的資源上[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，土壤磷酸酶活性與土壤P的有效性成反比[8]。當(dāng)土壤中微生物的生長受到P的限制時，微生物將增加對磷酸酶的投資，從而降低C∶P和N∶P酶活性比。類似的， 在很多生態(tài)系統(tǒng)中，N有效性的降低可以促進(jìn)N分解酶(如NAG和LAP)的活性的升高，而N有效性的升高則將抑制N分解酶的活性，提高對其他養(yǎng)分元素分解酶的投入[9]。在氮缺乏的夏威夷森林中，施氮造成了磷酸酶活性的提高，降低了N∶P酶活性比[9]。

除了資源有效性，土壤酶活性和化學(xué)計量也會受到土壤pH、溫濕度等因素的調(diào)控[1]。Zeglin等對McMurdo干旱河谷的研究表明，LAP∶AP與pH值表現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)關(guān)系[10]。此外，Sinsabaugh的meta分析發(fā)現(xiàn)ln(BG)∶ln(AP)與年均溫和年均降雨量之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，ln(BG)∶ln(NAG+LAP)和ln(NAG+LAP)∶ln(AP)與年均降雨量之間分別表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)和負(fù)相關(guān)關(guān)系[11]。

干旱和半干旱生態(tài)系統(tǒng)是陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，占據(jù)陸地表面的41%，承載著近38%的人口[12]。干旱區(qū)植被分布表現(xiàn)出明顯的斑塊狀，這種斑塊狀分布的形成通常是認(rèn)為受水分、養(yǎng)分資源從灌叢間空地遷移至灌叢下造成的[13]。由于灌叢的存在，其下土壤往往具有更高的有機(jī)質(zhì)輸入和更為溫和的土壤環(huán)境條件[14-15]，灌叢下與灌叢間空地土壤間養(yǎng)分資源有效性和土壤環(huán)境條件的差異，將對土壤生態(tài)酶活性化學(xué)計量特征造成影響。另一方面，對于年降雨量低于600 mm的生態(tài)系統(tǒng)，初級生產(chǎn)力被認(rèn)為主要受到土壤水分有效性的控制[16]。在干旱的森林和沙漠生態(tài)系統(tǒng)中均發(fā)現(xiàn)，干旱可以降低土壤酶活性。這種降低或許是因為在干旱條件下土壤微生物生物量的減少或者C、N、P養(yǎng)分資源的有效性和擴(kuò)散受到限制。然而，目前在干旱的斑塊狀分布的灌叢生態(tài)系統(tǒng)中，土壤生態(tài)酶活性的化學(xué)計量特征還少有研究，控制生態(tài)酶化學(xué)計量特征的土壤理化或者微生物因子更是不得而知。

本研究中，選取了岷江干旱河谷沿岸4個存在水分梯度的樣地，采集灌叢和空地土樣，測定了土壤基本物理化學(xué)性質(zhì)、微生物群落組成和酶活性，以期驗證以下3個假設(shè)：(1) 灌叢與空地間存在不同生態(tài)酶活性化學(xué)計量特征；(2) 樣地間生態(tài)酶活性化學(xué)計量特征將反映N、P資源的有效性，而同時 (3) 生態(tài)酶化學(xué)計量與N、P資源有效性之間的關(guān)系將會受到土壤水分有效性的控制。

1 研究方法

1.1 研究區(qū)域概況

岷江干旱河谷地區(qū)，行政區(qū)劃上隸屬于四川省阿壩藏族羌族自治州的汶川、理縣、茂縣、黑水和松潘，主要分布于松潘鎮(zhèn)江關(guān)以下，經(jīng)茂縣鳳儀鎮(zhèn)至汶川縣的岷江正河，位于102°33′—104°15′E，30°45′—33°09′N之間。該區(qū)域年平均氣溫10—11 ℃左右，降水量494.8 mm 左右，年蒸發(fā)量1332.4 mm，氣候干燥。土壤類型以山地褐土和山地棕壤土為主，土體十分干燥[17-18]。

1.2 土樣采集

本研究選取了岷江上游干旱河谷4個存在水分差異的樣地，樣地基本情況如表1所示。土壤樣品采集于2012年7月。每個樣地下設(shè)3個10 m×10 m的樣方，每個樣方內(nèi)五點(diǎn)法采集灌叢間空地0—15 cm土樣；選取樣方中處于優(yōu)勢地位的2種灌木(表1)，再分別選取3株個體大小類似、長勢健康的灌叢，采集下方0—15 cm的土壤。采集的土樣，立即放入便攜式冰盒中。土樣過2 mm篩后，分成3個部分：一部分約50 g土樣，放入4 ℃冰箱中保存，用于酶活性檢測；一部分約50 g土樣，經(jīng)冷凍干燥和球磨儀研磨后，儲藏在-80 ℃超低溫冰箱中(Themo Scientific) 用于磷脂脂肪酸(PLFA)分析；另外約100 g土樣，風(fēng)干后用于土壤理化性質(zhì)檢測。

表1 樣地基本概況

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)測定

土壤含水量(SWC)采用105 ℃連續(xù)烘干24 h后計算得出；pH值采用酸度計進(jìn)行測定(土∶水=1∶2.5)；總氮 (TN) 采用元素分析儀(vario MAX CN, Elementar)測定；有效氮(aN)采用堿解擴(kuò)散法；土壤有機(jī)碳(SOC)采用低溫外熱重鉻酸鉀氧化比色法測定；總磷 (TP)采用HClO4-H2SO4消煮-鉬銻抗比色法，連續(xù)流動分析儀(AutoAnalyzer 3, Bran+Luebbe)測定；有效磷 (aP) 采用NaHCO3浸提，鉬銻抗比色法。研究區(qū)域土壤基本理化性質(zhì)如表2所示。

1.3.2 土壤微生物群落PLFAs測定

PLFA的提取和純化參考Bligh and Dyer法[19-21]，上機(jī)前用1 mL含內(nèi)標(biāo)物19∶0的正己烷溶解吹干的脂肪酸甲酯，然后進(jìn)行GC-FID (Agilent 6850N) 檢測，脂肪酸種類通過脂肪酸 Sherlock 微生物鑒定系統(tǒng) (MIDI Inc., Newark, DE, USA) 來鑒定。PLFAs含量基于19∶0內(nèi)標(biāo)計算，分析中僅包括碳鏈數(shù)低于 20、摩爾百分比 (mol%) 含量大于1% 且在多數(shù)樣品中都有出現(xiàn)的脂肪酸。細(xì)菌 (B) 以14∶0、i14∶0、i15∶0、a15∶0、15∶1ω6c、i16∶0、16∶1ω7c、16∶1ω9c、i17∶0、a17∶0、17∶1ω8c、16∶1 2OH、cy17∶0、18∶1ω5c、cy17∶0和cy19∶0 C11-12等15種脂肪酸表示[20, 22]，真菌 (F) 用18∶2ω6c脂肪酸來估計[22]，菌根真菌 (AMF) 以16∶1ω5c表示[23]，真菌∶細(xì)菌比 (F∶B) 用真菌(F)與AMF的總量/細(xì)菌(B)。研究區(qū)域土壤PLFA主要類群含量如表2所示。

1.3.3 土壤生態(tài)酶活性測定

4種酶活性(BG、NAG、AP和LAP)的測定均采用96微孔酶標(biāo)板板熒光分析法[24-25]，具體如下：稱取1 g鮮土至800 mL的廣口燒杯中，加入125 mL，50 mmol的 Tris緩沖液(pH值調(diào)至每個10 m×10 m樣方的平均值，約為7.5)，渦旋震蕩1 min，使用八通道移液器 (Eppendorf) 向96孔酶標(biāo)板中加入200 μL土壤懸浮液(8個重復(fù))。每個樣品孔中加入50 μL，200 μmol/L的基底液(BG采用4-甲基傘形酮酰-β-D-吡喃葡糖酸苷 (4-MUB-β-D-glucoside) 為底物，NAG采用4-甲基傘形酮酰-β-D-吡喃葡糖酸苷 (4-MUB-N-acetyl-b-D-glucosaminide) 為底物，LAP采用L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素鹽酸鹽 (L-Leucine-7-amino-4-methylcoumarin) 為底物，AP采用4-甲基傘形酮磷酸酯 (4-MUB-phosphate) 為底物)；空白孔中加入250 μL Tris緩沖液；樣品控制孔中加入50 μL緩沖液和200 μL土壤懸浮液；基底控制孔中加入50 μL基底液和200 μL緩沖液。標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置：設(shè)置0, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 20, 30 μmol/L 8個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(其中，LAP的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度梯度設(shè)置為0, 2, 4, 8, 16, 24, 32, 40 μmol/L)，參考標(biāo)準(zhǔn)孔加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)液和200 μL緩沖液(8個重復(fù))，猝滅標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)液和200 μL懸浮液 (2個重復(fù))。

所有酶標(biāo)板放置在黑暗的20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h。使用多功能酶標(biāo)儀 (SynergyH4, BioTek) 進(jìn)行熒光測定。儀器自動在每個孔加入10 μL 1 mol/L的NaOH溶液，1 min后進(jìn)行熒光檢測。MUB和AMC在365 nm波長處激發(fā)，在450 nm處檢測熒光。酶活性計算如公式1所示：

Activity (nmol h-1g-1) = (凈熒光值×Buffer vol)/(ε×Homogenate vol×Time×Soil mass)

(1)

式中，net fluorescence (凈熒光值)= [(Assay -Homogenate Control)/Quench coefficient]-Substrate control，Quench coefficient (猝滅系數(shù))= (Quench control -Homogenate control) /Standard Fluorescence，ε為猝滅標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，Time為培養(yǎng)時間，Soil mass (g) 為土壤干重。4個樣地灌叢與空地中土壤酶活性值見表2。

1.4 數(shù)據(jù)分析

C∶N酶活性比，通過BG∶(NAG+LAP)計算；C∶P酶活性比，通過BG∶AP計算；N∶P酶活性比采用(NAG+LAP)∶AP計算[5]。樣地內(nèi)灌叢與空地間土壤生態(tài)酶活性比的差異采用T-檢驗。灌叢和空地土壤生態(tài)酶活性比在不同樣地間的差異使用單因素方差分析(One-way ANOVA)，結(jié)合SNK多重比較方法進(jìn)行探討。以上分析均通過了殘差正態(tài)和方差齊質(zhì)性檢驗。

使用標(biāo)準(zhǔn)主軸回歸(Standardized major axis, SMA)探討B(tài)G、NAG、LAP和AP 4種酶活性之間的關(guān)系，以及這種關(guān)系在不同樣地之間以及灌叢與空地之間的變異。標(biāo)準(zhǔn)主軸回歸相比與最小二乘法(Ordinary least squares, OLS)回歸，更加適用于X和Y(解釋變量與響應(yīng)變量)均是隨機(jī)的情況[26]。SMA回歸采用R 3.0.1軟件的“smatr”程序包中的“sma”函數(shù)，該函數(shù)允許檢驗不同斜率之間的差異性[27]。

表2 4個樣地，空地與灌叢土壤基本理化性質(zhì)、微生物生物量和生態(tài)酶活性(平均值，樣本量n=15—18)

為進(jìn)一步探討影響酶活性分配(由酶活性比指示)的土壤和微生物因子，使用了Pearson 相關(guān)分析檢驗了酶活比與土壤基本理化性質(zhì)和微生物群落組成因子之間的關(guān)系。由于之前的研究表明，該研究區(qū)域中，土壤含水量(SWC)對土壤微生物群落組成和生態(tài)酶活性具有重要影響，使用了逐步回歸分析，以期驗證SWC是否也是驅(qū)動酶活性比的重要因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣地間、樣地內(nèi)灌叢與空地間土壤生態(tài)酶活性比變異

灌叢和空地土壤在不同樣地間都具有顯著差異(圖1)。總體上來說，CJ和MT具有相對較高的BG∶(NAG+LAP)值和較低的BG∶AP和(NAG+LAP)∶AP值；LH和FH具有相對較低的BG∶(NAG+LAP)值和較高的BG∶AP和(NAG+LAP)∶AP值。

樣地內(nèi)，灌叢與空地之間酶活性比的變異要小的多(圖1)，BG∶(NAG+LAP)與BG∶AP僅在MT表現(xiàn)出顯著差異，(NAG+LAP)∶AP也僅在FH表現(xiàn)出顯著差異。

2.2 不同樣地間、樣地內(nèi)土壤生態(tài)酶活性回歸分析

SMA回歸分析表明，整體上ln(BG)與ln(NAG+LAP)和ln(AP)之間有較好的線性關(guān)系(Slope=1.516 (r2=0.291) & 1.049 (r2=0.579))，而ln(NAG+LAP)與ln(AP)無顯著線性關(guān)系(圖2)。進(jìn)一步的斜率檢驗表明，灌叢下和空地中土壤酶活性之間的線性模型斜率之間無顯著差異，且與總體的斜率也沒有顯著差異(圖2，表4)。

對各樣地分別進(jìn)行的SMA回歸分析表明，樣地之間酶活性比斜率的差異主要存在于LH、FH和CJ、MT之間。對于ln(BG) vs. ln(NAG+LAP)， FH樣地的SMA回歸斜率顯著高于CJ樣地和總體的斜率(Slope = 2.516 vs. 1.326 & 1.516)；對于ln(BG) vs. ln(AP),CJ和MT樣地的斜率要顯著的高于LH樣地和總體的斜率(Slope=1.659 & 1.756 vs. 0.942 & 1.049)；對于ln(NAG+LAP) vs. ln(AP)，LH和FH樣地的斜率顯著低于CJ和MT樣地(Slope=0.494 & 0.548 vs. 1.251 & 1.217)。

2.3 影響酶活性比變異的主要因子

2.2節(jié)的分析表明，灌叢和空地土壤生態(tài)酶活性比的分布規(guī)律無明顯的差異，因此本節(jié)的相關(guān)分析和回歸分析將灌叢和空地作為一個整體進(jìn)行分析。Pearson相關(guān)分析表明，ln(BG)∶ln(NAG+LAP)與SWC、SOC、C∶P、AMF、F∶B、TN、N∶P等因子都表現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)關(guān)系(表4)。與此相反的是，ln(NAG+LAP)∶ln(AP)與SWC、SOC、C∶P、N∶P、AMF、F∶B、TN等因子呈現(xiàn)極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。而ln(BG)∶ln(AP)則未與本研究中任何因子表現(xiàn)出顯著的相關(guān)關(guān)系。

圖1 不同樣地間、樣地內(nèi)灌叢與空地土壤生態(tài)酶活性比變異 (平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，樣本量n=15-18)Fig.1 The variation of soil enzymatic ratios in the soils under shrub canopies and in the shrub-interspaces (Gap) across the four sites (mean ± sd, n=15—18)BG:(NAG+LAP)表示碳氮酶活性比；BG:AP表示碳磷酶活性比；(NAG+LAP):AP 表示氮磷酶活性比;LH: 兩河口(Lianghekou), FH: 飛虹(Feihong), CJ: 撮箕(Cuoji), MT:牟托(Moutuo);圖中小寫字母表示不同樣地間空地或灌叢土壤胞外酶活性比存在顯著性(P<0.05)，*表示灌叢與空地間土壤胞外酶活性比存在顯著差異(P<0.05)

表3 不同樣地間灌叢下和空地中幾種土壤生態(tài)酶活性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)主軸分析

進(jìn)一步的逐步回歸分析表明，SWC、SOC、AMF、TP和C∶P共同解釋了ln(BG)∶ln(NAG+LAP) 50.27%的變異，其中SWC、AMF和C∶P依次解釋了其中28.05%、24.38%和21.82%的變異，而在相關(guān)分析中有良好表現(xiàn)的SOC則只解釋了其中14.6%的變異。對于ln(NAG+LAP)∶ln(AP)，SWC、N∶P、C∶N和F∶B共同解釋了51.56%的變異，其中SWC單獨(dú)即解釋了其中41.26%的變異，其次是N∶P比和C∶N比，分別解釋了27.33%和22.47%的變異。而對于ln(BG)∶ln(AP)，C∶P則是唯一具有顯著影響的因子，解釋了9.38%的變異，盡管在相關(guān)分析中并為發(fā)現(xiàn)它們之間顯著的線性關(guān)系。

圖2 不同樣地間土壤C、N、P酶活性之間的標(biāo)準(zhǔn)主軸回歸分析Fig.2 Standardized major axis regressions of the C-, N-, and P-related soil extracellular enzyme activities across the four sites圖中虛線、點(diǎn)線和實(shí)現(xiàn)分別表示的是對灌叢(樣本量n=65)、空地(樣本量n=57)和全部數(shù)據(jù)(樣本量n=122)的回歸擬合分析，數(shù)據(jù)經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)換(ln);BG: β-1,4-葡萄糖苷酶 β-1,4-glucosidase； NAG: β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶 β-1,4-N-acetylglucosaminidase； LAP: 亮氨酸氨基肽酶 leucine aminopeptidase； AP:堿性磷酸酶 acid or alkaline phosphatase

表4 土壤生態(tài)酶活性比與土壤理化性質(zhì)和微生物群落組成因子間的Pearson相關(guān)分析

3 討論

3.1 養(yǎng)分限制

土壤酶是分解土壤有機(jī)質(zhì)的主力，其活性可以為探討土壤養(yǎng)分限制提供一些有價值的信息[11, 28]。全球尺度上，土壤BG∶(NAG+LAP)比為1.41，BG∶AP比為0.62，(NAG+LAP)∶AP比為0.44[5]。本研究區(qū)域中，BG∶(NAG+LAP)的平均值為0.73，明顯小于1.41的全球平均值; (NAG+LAP)∶AP的平均值為1.15，也顯著的高于全球均值(1.15 vs. 0.44[5])。這意味著該區(qū)域土壤整體具有相對較高的N分解胞外酶活性(基于全球尺度)，從而或許也從側(cè)面反映了土壤N元素的相對缺乏，使得微生物需要生產(chǎn)更多的N分解酶，以滿足自身代謝的需要。以往的研究中發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)水分和P是限制植物生長的第一和第二限制因子，而N則無顯著的限制作用[29-30]。但由于該區(qū)域大多數(shù)的研究針對的是植物，缺乏對微生物生長代謝限制性因子的研究。本研究從生態(tài)酶化學(xué)計量學(xué)的角度，為研究岷江干旱河谷灌叢群落土壤微生物生長代謝的限制性因子，提供了一個參考。

表5 影響土壤生態(tài)酶活性比變異的土壤物理化學(xué)和微生物因子的逐步回歸分析

從各樣地情況來看，LH和FH 2個樣地微生物生長的N限制作用可能更為突出(BG∶(NAG+LAP)=0.60 & 0.54 vs. 1.41; (NAG+LAP)∶AP=1.34 & 1.79 vs. 0.44)，而這2個樣地也正是本研究中2個相對更為干旱的樣地。從表2中也可看出，LH和FH 2個樣地TN和aN也相對較低。較低的N有效性加上較低的水分有效性的進(jìn)一步限制，造成了這2個樣地相對明顯的N限制作用。而對于本研究中相對濕潤的CJ和MT樣地，則較LH和FH具有相對較低的BG∶AP活性比和顯著低的(NAG+LAP)∶AP活性比，這說明CJ和MT樣地微生物生長可能存在一定的P限制。

由于灌叢的存在，灌叢下土壤較空地土壤可以獲取更多的有機(jī)質(zhì)輸入(凋落物、根系分泌物等)，提高土壤養(yǎng)分有效性，從而進(jìn)一步作用于土壤酶活性以及酶活性化學(xué)計量。本研究中盡管總體上灌叢與空地土壤酶活性比之間無顯著差異，但在MT和FH 2個樣地也觀測到灌叢的顯著作用(圖1)。MT樣地灌叢下更高的C∶N和C∶P酶活性比，或反映了空地中土壤微生物相對更高的N、P功能發(fā)揮；FH樣地空地中顯著高的N∶P酶活性比，也指示著空地土壤微生物更高的N資源功能發(fā)揮(相對于P)。FH樣地空地中土壤TN和aN含量都明顯低于灌叢土壤 (TN: 2.92 vs. 3.21 g/kg，aN:105.72 vs. 120.43 mg/kg)，而TP則幾乎與灌叢土壤相等 (0.43 vs. 0.44 g/kg)，aP含量甚至高于灌叢土壤(22.56 vs. 17.10 mg/kg)；對于MT樣地，空地中土壤TN、aN和aP 都極顯著地低于灌叢土壤(TN: 2.95 vs. 3.87 g/kg，aN:79.35 vs. 143.84 mg/kg，aP: 7.32 vs. 17.05 mg/kg)。這些養(yǎng)分資源含量數(shù)據(jù)都進(jìn)一步的佐證了本文的判斷。盡管空地中SOC也較灌叢下低(FH & MT)，但相比與N、P來說，SOC對于土壤微生物來說可能是相對充裕的。

3.2 酶活性關(guān)系特征

全球尺度上，C∶N∶P酶活性比大體呈現(xiàn)1∶1∶1的尺度關(guān)系，反映了C、N、P循環(huán)之間的一種耦合關(guān)系[5]。本研究中，不同樣地間C∶N酶活性SMA回歸斜率顯著高于全球尺度上的C∶N酶活性SMA回歸斜率(Slope=1.5 vs. 1.02)，而C∶P酶活性回歸斜率則與全球尺度的相當(dāng)(Slope=1.03 vs. 1.04)，C∶N∶P酶活性比大致為3∶2∶3，這反映了岷江干旱河谷地區(qū)相對不同的C、N、P循環(huán)特征。

樣地間，灌叢與空地土壤生態(tài)酶活性化學(xué)計量特征的相似性(圖2)，指示著灌叢與空地土壤微生物C、N、P需求和C∶N∶P化學(xué)計量的相似性，這可以從各樣地中灌叢與空地之間SOC、TN和TP含量的較小差異得到反映(表2)。因此，這說明本研究的假設(shè)(1)沒有得到支持。而已有研究表明，灌叢與空地，這2個看似生物地球化學(xué)循環(huán)獨(dú)立的存在[31]，可能通過地下復(fù)雜的真菌網(wǎng)絡(luò)有機(jī)地聯(lián)系起來[32-33]，從而可能造成灌叢與空地間相似的酶活性化學(xué)計量特征。

3.3 影響酶活性化學(xué)計量特征的土壤理化和微生物因子

土壤酶活性化學(xué)計量受土壤C、N、P資源的有效性的調(diào)控。本研究中，土壤C∶N與BG∶(NAG+LAP)之間未表現(xiàn)出顯著相關(guān)性，土壤C∶P比與BG∶AP僅呈弱的正相關(guān)關(guān)系，唯有土壤N∶P比與N∶P酶活性比表現(xiàn)出極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。一方面，這或許說明土壤酶活性比不能很好地反映土壤有機(jī)質(zhì)的元素組成。土壤酶來自于土壤微生物，其相對活性或許更多的反映土壤微生物生物量的元素組成。而另一方面，其他土壤生物或非生物因子或許對酶活性比的變異有著更為強(qiáng)烈的影響，從而掩蓋了酶活性比與土壤元素組成的相關(guān)性。事實(shí)上，相關(guān)分析表明，SWC、SOC、TN、C∶P、AMF以及F∶B均與土壤C∶N和C∶P酶活性比呈極顯著相關(guān)，這些因子共同驅(qū)動著酶活性比的分布。然而，本研究中涉及到的土壤因子均不能很好地解釋C∶P酶活性比的變異。造成這種結(jié)果的原因，可能是某些未測量的環(huán)境因子，如土壤溫度、團(tuán)聚體、土壤有機(jī)酸、空間自相關(guān)等更為強(qiáng)烈的影響C∶P酶活性比的變異[34-36]。

本研究充分證明了第二個假設(shè)：土壤酶活性化學(xué)計量特征與土壤C、N、P養(yǎng)分有效性之間的關(guān)系受到土壤水分有效性的調(diào)控。逐步回歸反映了SWC是影響B(tài)G∶(NAG+LAP)和(NAG+LAP)∶AP變異的最主要因子。事實(shí)上，當(dāng)以SWC作為協(xié)變量進(jìn)行偏回歸分析，SOC、C∶P、N∶P、AMF等與酶活性比顯著相關(guān)的因子的顯著性都未能通過顯著性檢驗(數(shù)據(jù)未展示)。這反映了土壤水分有效性在岷江干旱河谷地區(qū)土壤養(yǎng)分循環(huán)中的決定性作用。SWC與BG∶(NAG+LAP)呈正相關(guān)關(guān)系，而與(NAG+LAP)∶AP呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即SWC的降低，C∶N酶活性比降低，N∶P酶活性比升高，從而說明，SWC的降低，將造成N分解酶活性的“相對升高”。這或許是因為干旱加劇了N的有效性，而另一方面，酶活性更多的是反映微生物為獲取養(yǎng)分資源而進(jìn)行的一種功能發(fā)揮，N分解酶活性的“相對升高”，或許反映了微生物需要將更多的功能發(fā)揮轉(zhuǎn)向N的攝取上，以維持自身C∶N∶P生物量的平衡。從表2中可見，LH和FH 2個相對干旱的樣地，其N的有效性也相對降低。氣候變化研究認(rèn)為，未來氣候變化將對干旱生態(tài)系統(tǒng)施加嚴(yán)重的壓力，表現(xiàn)為溫度升高、降雨減少、降雨強(qiáng)度和頻度變化[37]。已有研究認(rèn)為，在快速氣候變化背景下，由于生物和地球化學(xué)過程對不同元素所施加的控制程度不同，C、N、P循環(huán)可能會發(fā)生解耦合現(xiàn)象[31, 38-42]。因此，未來氣候變化，特別是降雨量的減少將有可能進(jìn)一步限制岷江干旱河谷區(qū)域土壤N的有效性，強(qiáng)烈改變本區(qū)域的C、N、P循環(huán)的耦合關(guān)系。

土壤生態(tài)酶活性化學(xué)計量不僅可以反映土壤養(yǎng)分資源的有效性，也可以指示微生物群落結(jié)構(gòu)和養(yǎng)分需要的變化[5]。相關(guān)分析和逐步回歸分析顯示，AMF、F∶B比與酶活性比呈顯著相關(guān)，其中AMF更是除SWC外，影響B(tài)G∶(NAG+LAP)變異的最重要因子(表4，表5)。本研究中AMF和F∶B與BG∶(NAG+LAP)呈現(xiàn)正相關(guān)，與(NAG+LAP)∶AP呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，而Bragazza 等對泥炭地的研究中也發(fā)現(xiàn)，C∶N和C∶P酶活性比隨F∶B比的升高而升高，而N∶P酶活性比則隨著F∶B的升高而降低[43]。這說明微生物群落結(jié)構(gòu)的變化和土壤真菌類群，特別是AMF的相對富集有利于BG酶和AP酶活性的相對提高。研究亦表明，真菌相比于細(xì)菌具有更高的C資源需求[44]；當(dāng)土壤N∶P比較高時，真菌的生長易受到P的限制[45]，從而促使真菌生產(chǎn)更多的磷酸酶以獲取更多的P，維持自身N、P的平衡。因此，本研究結(jié)果反映了土壤真菌群落在岷江干旱河谷地區(qū)C、P循環(huán)中的重要地位，反之，則說明了土壤細(xì)菌類群在岷江干旱河谷地區(qū)N循環(huán)中的重要作用，這與黃元元、王冰冰的研究結(jié)果是一致的[46-47]。

3.4 本研究的不足

本研究中，沒有觀測到不同樣地尺度上，N、P酶活性之間顯著的線性關(guān)系，這在一定程度上降低了關(guān)于C∶N∶P酶活性化學(xué)計量特征討論的效力。其原因，大概有兩點(diǎn)：其一，ln(NAG+LAP)可能不是表征N分解酶活性的良好指標(biāo)。從表2中可見，NAG酶活性相對其他3種酶活性值非常的低，從而ln(NAG+LAP)值受LAP的影響很大，其與BG或AP酶活性的尺度關(guān)系，基本上與LAP和BG或AP的關(guān)系一致；而對這4種酶活性的相關(guān)分析表明，NAG、BG和AP 3種酶活性之間有著極顯著的正相關(guān)關(guān)系，LAP則與這3種酶活性之間無顯著相關(guān)關(guān)系。Sinsabaugh 等的對全球24個生態(tài)系統(tǒng)土壤酶活性的主成分分析，發(fā)現(xiàn)LAP呈現(xiàn)出與NAG、BG和AP截然不同的分布特征[11]。另一方面，造成這種現(xiàn)象的原因可能與檢測方法有關(guān)。NAG、BG和AP 3種酶活性檢測的基質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)都是基于MUB的，而LAP則是基于AMC的，從而這種方法學(xué)上的差異，可能造成了LAP與其他酶活性之間的解耦合。

4 結(jié)論

本研究反映了岷江干旱河谷區(qū)域土壤酶活性化學(xué)計量特征的相對特異性。灌叢與空地土壤酶活性化學(xué)計量特征表現(xiàn)出一定的相似性。岷江干旱河谷區(qū)域整體上存在一定的N限制，而對于個樣地來說，相對干旱的樣地N限制更為明顯，而相對濕潤的樣地則又表現(xiàn)出一定的P限制。這種樣地之間的差異性，主要受到土壤含水量的調(diào)控。土壤含水量的降低，促使土壤N分解酶活性的相對升高，從而意味著未來可能的降水降低，或?qū)⒓觿”緟^(qū)域的N限制。

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Patterns of ecoenzymatic stoichiometry in the dominant shrubs in the semi-arid Upper Minjiang River Valley

WANG Bingbing1, 2, QU Laiye1,*, MA Keming1, ZHANG Xinyu3, SONG Chengjun4

1StateKeyLaboratoryofUrbanandRegionalEcology,ResearchCenterforEco-EnvironmentalSciences,ChineseAcademyofSciences,Beijing100085,China2UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China3KeyLaboratoryofEcosystemNetworkObservationandModeling,InstituteofGeographicSciencesandNaturalResourcesResearch,ChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China4ChineseAcademyofAgriculturalengineering,Beijing100125,China

The activities of soil ecoenzymes in relation to the mineralization of soil organic carbon, nitrogen, and phosphorus can reveal stoichiometric and energy limitations on the growth and metabolism of soil microbes. Despite the fact that arid and semi-arid ecosystems have received considerable attention in recent years, studies on the patterns of soil ecoenzymatic stoichiometry and the relationships among soil physiochemical and microbial community factors are still rare. In this study, we investigated the variations of soil physiochemical properties, microbial community composition, and EEAs by comparing soils in dominant shrubs and in the shrub-interspaces at four sites (Lianghekou, Feihong, Cuoji, and Moutuo). These study sites were expected to differ with respect to the level of water stress along the semi-arid valley in the upper Minjiang River, Sichuan province. The patterns of ecoenzymatic stoichiometry of C∶N∶P were different in the semi-arid Minjiang River valley as compared to those in the global pattern (C∶N∶P=3∶2∶2 vs. 1∶1∶1). Overall, there may be some degree of nitrogen limitation of microbial metabolism in this semi-arid region, which was supported by the relative activities of β-glucosidase compared to β-N-acetylglucosaminidase + leucine aminopeptidase and β-N-acetylglucosaminidase + leucine aminopeptidase to phosphatase. The different patterns of enzymatic stoichiometry between the soils in shrubs and in the shrub interspaces were not obvious. However, the limitation of C, N, and P resources in each individual site was somewhat site specific and may be due to the soil water availability. The two relatively drier sites (Lianghekou and Feihong) were more constrained by nitrogen availability, while the two relatively wetter sites (Cuoji and Moutuo) were more constrained by phosphorus availability. The variations of soil enzymatic stoichiometric patterns were affected by nutrient availabilities and soil water content as shown by the Pearson product-moment correlation analysis. The results of stepwise regression further revealed that the variations of enzyme ratios, such as C∶N and N∶P, were driven primarily by soil water content. Soil water content was positively correlated with the C∶N enzyme ratio and negatively correlated with the N∶P enzyme ratio. We also observed that arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and the fungi-to-bacteria ratio positively correlated with the C∶N enzyme ratio, but negatively with the N∶P enzyme ratio, which may imply that the enrichment of fungi and AMF communities will benefit C and P cycling by influencing enzyme activities. Our results suggest that any predicted decrease in soil water with climate change will probably further constrain the availability of N and P in this N-limited ecosystem in the semi-arid region. Moreover, this study also highlights the important role of fungi and AMF communities in meditating C and P cycling in this semi-arid region.

Minjiang River; semi-arid river valley; ecoenzymatic stoichiometry; nutrient availability; soil water content

國家自然科學(xué)基金(31170581, 41101270)

2014-01-27;

日期:2014-11-19

10.5846/stxb201401270202

*通訊作者Corresponding author.E-mail: lyqu@rcees.ac.cn

王冰冰, 曲來葉, 馬克明, 張心昱, 宋成軍.岷江上游干旱河谷優(yōu)勢灌叢群落土壤生態(tài)酶化學(xué)計量特征.生態(tài)學(xué)報,2015,35(18):6078-6088.

Wang B B, Qu L Y, Ma K M, Zhang X Y, Song C J.Patterns of ecoenzymatic stoichiometry in the dominant shrubs in the semi-arid Upper Minjiang River Valley.Acta Ecologica Sinica,2015,35(18):6078-6088.