梁 曉， 張學(xué)蘭， 李慧芬， 孟 艷

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355）

甘草汁蒸制遠(yuǎn)志對(duì)遠(yuǎn)志皂苷B和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含有量的影響

梁 曉， 張學(xué)蘭*， 李慧芬， 孟 艷

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355）

目的觀察甘草汁蒸制遠(yuǎn)志過程中對(duì)遠(yuǎn)志皂苷B和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含有量的動(dòng)態(tài)變化。方法采用HPLC同時(shí)測(cè)定遠(yuǎn)志生品及甘草汁蒸制不同時(shí)間 （4、8、12、16、20、24 h）炮制品中遠(yuǎn)志皂苷B和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的量。色譜柱為Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸溶液，梯度洗脫；體積流量1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。結(jié)果隨著蒸制時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含有量逐漸升高，而遠(yuǎn)志皂苷B含有量變化不大。結(jié)論遠(yuǎn)志中遠(yuǎn)志皂苷B含有量較高，達(dá)到2.23%；甘草汁蒸制僅對(duì)遠(yuǎn)志中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含有量影響顯著，但對(duì)遠(yuǎn)志皂苷B含有量無明顯影響。

遠(yuǎn)志；甘草汁蒸制；遠(yuǎn)志皂苷B；細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷；HPLC

遠(yuǎn)志為臨床常用的中藥，具有安神益智、交通心腎等功效，但生遠(yuǎn)志有毒，能 “戟人咽喉”，故臨床主用其炮制品入藥。歷代遠(yuǎn)志的炮制方法主要有去心、甘草汁煮、甘草汁蒸、酒蒸、蜜炙等，現(xiàn)代主要采用甘草汁制［1］。中醫(yī)認(rèn)為，甘草汁制遠(yuǎn)志可減緩其 “戟人咽喉”的燥性，協(xié)同其補(bǔ)脾益氣、安神益智之功效［2］。

遠(yuǎn)志主要含有三萜皂苷類、糖酯類等成分。其中皂苷類成分主要有遠(yuǎn)志皂苷A、B、E、F、G、K、V等30余種；糖酯類成分主要有3，6＇-二芥子?；崽恰enuifoliside A～E、tenuifolise A～Q、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A1～A6等［3］。藥理研究表明，遠(yuǎn)志中皂苷類成分具有抗癡呆、腦保護(hù)、鎮(zhèn)靜和免疫佐劑等活性［4-7］。而遠(yuǎn)志皂苷堿水解物具有安神益智的藥效，但毒性較原皂苷顯著降低［8］。另有研究表明，生遠(yuǎn)志急性毒性較大，可顯著抑制大鼠的胃腸運(yùn)動(dòng)和消化功能，而甘草制遠(yuǎn)志的抑制作用明顯減弱［9-10］。遠(yuǎn)志經(jīng)不同方法炮制后，遠(yuǎn)志酸、遠(yuǎn)志皂苷元含有量略有增加［11-12］，但迄今其炮制機(jī)理尚不明確，炮制對(duì)遠(yuǎn)志中其他皂苷類成分的影響少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC同時(shí)測(cè)定遠(yuǎn)志生品及甘草汁蒸制不同時(shí)間炮制品中遠(yuǎn)志皂苷B與細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷，探討遠(yuǎn)志甘草汁蒸制過程中遠(yuǎn)志皂苷B與細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的變化規(guī)律，為揭示遠(yuǎn)志炮制機(jī)理及制定其不同飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

L-2000高效液相色譜儀 （日本日立公司）；FA1604N型電子天平 （上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器 （江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；高效液相用乙腈 （色譜純，德國(guó)默克公司）；娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

遠(yuǎn)志飲片購自山東百味堂中藥飲片有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室周鳳琴教授鑒定為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifolia Willd干燥根的去心段狀飲片。制遠(yuǎn)志方法為取凈遠(yuǎn)志共6份，各50 g，分別加甘草汁25 m L（甘草汁的制備：取凈甘草片36 g，加相當(dāng)于甘草片質(zhì)量的10、8倍量水，煎煮2次，每次1 h，合并兩次煎液，濃縮至300 mL），置不銹鋼飯盒中，悶潤(rùn)1 h，分別蒸制4、8、12、16、20、24 h，取出，40℃烘干。

遠(yuǎn)志皂苷B對(duì)照品 （成都普瑞法科技有限公司，批號(hào)MUST-13100801，純度≥98%）；細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對(duì)照品 （成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)A0345，純度≥98%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈 （A）-0.05%磷酸溶液 （B），梯度洗脫 （0～15 min，28%A；15～20 min，28%→40%A；20～30 min，40%A；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，體積流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量40μL。在上述色譜條件下，遠(yuǎn)志皂苷B、細(xì)葉遠(yuǎn) 志皂苷與其他組分分離度良好，色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品（A）、遠(yuǎn)志生品（B）和甘草汁蒸制24 h（C）HPLC圖Fig.1 Chromatograms ofm ixed reference substances onjisaponin B and tenuifolin（A），raw herbal pieces（B）and licorice juice steam ing 24 h（C）

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取遠(yuǎn)志皂苷B 5.02 mg、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷1.91 mg，分別置于5 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度。精密量取遠(yuǎn)志皂苷B和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對(duì)照品溶液各0.5 mL，置同一2 m L量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，制成遠(yuǎn)志皂苷B質(zhì)量濃度為0.251 mg/m L，細(xì)葉遠(yuǎn)皂苷質(zhì)量濃度為0.095 5 mg/m L的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取遠(yuǎn)志生品及各炮制品粉末 （過40目篩）各約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取60 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，以微孔濾膜 （0.45μm）濾過，作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 精取 “2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液3、8、10、20、40μL，注入液相色譜儀，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰峰面積，以進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積 （Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，遠(yuǎn)志皂苷B線性回歸方程為Y=286.54 X-24.030，r=0.999 8，其線性范圍為0.750～10.0μg；細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷線性回歸方程為Y=286.48X+36.024，r=0.999 9，其線性范圍為0.285～3.80μg。

2.5 精密度試驗(yàn) 精取甘草汁蒸制20 h遠(yuǎn)志供試品溶液，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷和遠(yuǎn)志皂苷B的峰面積，RSD分別為1.4%、1.1%。表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取甘草汁蒸制20 h遠(yuǎn)志供試品溶液，在室溫下自然放置，分別在0、2、4、8、 12、24 h按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)定細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷和遠(yuǎn)志皂苷B的峰面積，RSD分別是1.7%，1.4%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取甘草汁蒸制20 h遠(yuǎn)志粉末（過40目篩），平行6份，各約0.25 g，按 “2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件依法測(cè)定，記錄細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志皂苷B的峰面積，計(jì)算其含有量，RSD分別為1.6%、1.8%。表明該方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)知含有量的甘草汁蒸制20 h遠(yuǎn)志粉末 （過40目篩），共6份，各約0.1 g，精密稱定，分別精密加入細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷（0.330 mg/mL）、遠(yuǎn)志皂苷B（1.10 mg/mL）對(duì)照品溶液各1 mL，再以70%甲醇補(bǔ)足至25 mL，按 “2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of recovery tests（n=6）

2.9 樣品含有量測(cè)定 精密吸取混合對(duì)照品溶液20μL和供試品溶液40μL，注入液相色譜儀分析測(cè)定，按干燥品計(jì)算樣品中各指標(biāo)成分含有量，結(jié)果見表2。

表2 遠(yuǎn)志皂苷B、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含有量測(cè)定結(jié)果 （n=2）Tab.2 Results of onjisaponin B and tenuifolin content determ ination（n=2）

3 小結(jié)與討論

本研究采用HPLC梯度洗脫的方法同時(shí)測(cè)定遠(yuǎn)志生品及甘草汁蒸制遠(yuǎn)志炮制品中的遠(yuǎn)志皂苷B和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷。結(jié)果表明，該方法靈敏可靠、重復(fù)性好，為完善遠(yuǎn)志飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了準(zhǔn)確簡(jiǎn)便可行的測(cè)定方法。

本研究顯示，遠(yuǎn)志生品中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含有量甚低，未能檢出，而遠(yuǎn)志皂苷B含有量較高，達(dá)2.23%。隨著蒸制時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含有量逐漸增加，而遠(yuǎn)志皂苷B含有量無明顯變化。遠(yuǎn)志皂苷是由齊墩果酸型五環(huán)三萜和苯丙素以及糖類形成的一類酯類化合物，且大多數(shù)皂苷分子中含有細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷母核。遠(yuǎn)志甘草蒸制后，細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷量增加，可能是由于在蒸制過程中，部分皂苷分子中的酯鍵水解，生成次級(jí)苷細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷，而遠(yuǎn)志皂苷B性質(zhì)較穩(wěn)定，在甘草汁蒸制過程中不易水解。遠(yuǎn)志用甘草汁炮制后緩和燥性，增強(qiáng)安神益智藥效，可能與在蒸制過程中部分皂苷類成分水解密切相關(guān)，至于甘草汁在炮制中的作用有待深入研究。

《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定，遠(yuǎn)志飲片中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的含量測(cè)定方法應(yīng)用堿水解法［13］，這種方法測(cè)定的是遠(yuǎn)志皂苷經(jīng)水解后產(chǎn)生的細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷量，不能確切反映炮制品中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的真實(shí)含有量。為了探討遠(yuǎn)志炮制過程中遠(yuǎn)志皂苷B和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的變化規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取后直接測(cè)定。

［1］毛福英，趙云生，王建寰.遠(yuǎn)志炮制歷史沿革及研究進(jìn)展［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2010，6（10）：148-150.

［2］單建學(xué).遠(yuǎn)志的炮制及臨床應(yīng)用［J］.湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2001，7（2）：89.

［3］劉大偉，康利平，馬百平.遠(yuǎn)志化學(xué)及藥理作用研究進(jìn)展［J］.國(guó)際藥學(xué)研究，2012，39（1）：32-36.

［4］趙大鵬，李曉峰，陳樹沙，等.遠(yuǎn)志總皂苷對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬nAChRα7亞基的影響［J］.中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2012，19（5）：349.

［5］Li C J，Yang JZ，Yu SS，et al.Triterpenoid saponins with neuroprotective effects from the roots of Polygala tenuifolia［J］. Planta Med，2008，7（2）：133-141.

［6］Chung IW，Moore N A，Oh W K，et al.Behavioural pharmacology of polygala saponins indicates potential antipsychotic efficacy［J］.Pharmacol Biochem Behav，2002，71（12）：191-195.

［7］Takayuki N，Yujiro S，Hiroaki K，et al.Onjisaponins，from the root of Polygala tenuifolia W illdenow，as effective adjuvants for nasal influenza and diphtheria-pertussis-tetanus vaccines［J］.Vaccine，2001，19（32）：4824-4834.

［8］Xu S P，Yang Y Y，Xue D，et al.Cognitive enhancing effects of Polygalasaponin Hydrolysate inαβ25-35induced amnesic mice［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2011，2011：1-12.

［9］吳暉暉，王 建，劉賢武，等.遠(yuǎn)志及其不同蜜炙品的急性毒性及其對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)的影響［J］.四川中醫(yī)，2006，24（11）：16-18.

［10］王 建，郭 娟，武 云.遠(yuǎn)志不同炮制品對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)及消化功能的影響［J］.中藥藥理與臨床，2006，22（3）：120-124.

［11］房敏峰，付志玲，王相人，等.炮制對(duì)遠(yuǎn)志中皂苷元類成分的影響［J］.藥物分析雜志，2009，29（3）：452-456.

［12］林敬開，閆小平，官仕杰，等.遠(yuǎn)志不同炮制品皂苷類成分含量的比較［J］.中藥實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（11）：89-91.

［13］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：146.

Effect of Polygala tenuifolia steamed with licorice extract on content changes of onjisaponin B and tenuifolin

LIANG Xiao， ZHANG Xue-lan*， LIHui-fen， MENG Yan

（Shandong University of Tranditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China）

AIMTo explore the content changes of onjisapion B and tenuifolin in the process of Polygala tenuifolia steamed with licorice extract.M ETHODSThe contents of onjisapion B and tenuifolin in c rude and steamed products of Polygala tenuifolia were determ ined by HPLC at intervals of 4，8，12，16，20，and 24 h.The analyses of samples were performed on Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）with the mobile phase consisting ofwater containing acetonitrile and 0.05%phosphoric acid solution in a gradient program mode，flow rate was 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at210 nm.RESULTSWith the extension of steaming time，tenuifolin content increased significantly，but onjisaponin B content had little change.CONCLUSIONOnjisaponin B content in Polygala tenuifolia possesses higher content，reaching 2.23%，steam ing with licorice extract plays a significant role in increasing tenuifolin content，buthas a little influence on onjisaponin B content.

Polygala tenuifolia；steamed with licorice extract；onjisaponin B；tenuifolin；HPLC

R283

A

1001-1528（2015）04-0824-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.029

2014-07-27

國(guó)家重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng) （2011ZX09102-003-06）

梁 曉 （1989—），女，碩士生，從事中藥新藥研發(fā)與中藥炮制原理研究。Tel：15965643940，E-mail：782404001@qq.com

*通信作者：張學(xué)蘭 （1963—），女，教授，從事中藥新藥研發(fā)與中藥炮制研究。Tel：（0531）89628081，E-mail：zhang8832440@sina.com