勾中智，徐維盛，劉靜，易有金，楊月欣，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所，北京100050；3.北京市科學(xué)技術(shù)研究院北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所，北京100069）

臍橙，屬無(wú)患子目、蕓香科、柑橘屬類(lèi)水果[1]。柑橘類(lèi)水果富含多種活性成分，對(duì)人體健康有預(yù)防和保健的作用，目前已經(jīng)從柑橘中鑒定出的類(lèi)黃酮物質(zhì)有60多種[2]，主要包括：黃酮類(lèi)、黃酮醇類(lèi)、黃烷酮類(lèi)以及花色苷類(lèi)，其中黃烷酮類(lèi)含量最高，約占類(lèi)黃酮總量的80%[3]，檸檬苦素類(lèi)化合物檸檬苦素及諾米林也具有較高的含量。目前，柑橘類(lèi)水果中黃酮類(lèi)及檸檬苦素類(lèi)功效成分的檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜法[4-9]、超高效液相色譜技術(shù)（UPLC）[10-11]、液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）[12-15]、液-核聯(lián)用技術(shù)（LC-NMR）[16]等。目前柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林等6種黃酮類(lèi)和檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)方法尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，本文首次建立了該6種功效成分同時(shí)檢測(cè)的RP-HPLC檢測(cè)方法，并測(cè)定了其在臍橙中的含量，獲得了滿(mǎn)意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器，四元梯度泵，Chemical station色譜工作站：美國(guó)安捷倫公司；ME235S型分析天平：德國(guó)Sartorius集團(tuán)；EYECA OSB-2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛(ài)朗儀器有限公司；SHB-Ш型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；YKKY DX-208型低溫循環(huán)機(jī)：北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器公司；KQ-500 DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品

柚皮苷（批號(hào)：15495000-20917）、橙皮苷（批號(hào)：14140000-10428），均購(gòu)于 Dr.Ehrenstorfer GmbH；柚皮素（批號(hào)：CDHJ-STA-02206006）、橙皮素（批號(hào)：CDHJSTA-67900000）、檸檬苦素（CDHJ-STA-28543004）、諾米林（批號(hào)：CDHJ-STA-77000000）均購(gòu)于上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司；贛南臍橙和秭歸臍橙由江西省臍橙工程技術(shù)研究中心提供；美國(guó)新奇士臍橙購(gòu)于北京新發(fā)地水果市場(chǎng)。

1.3 試劑

乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Chemical）；磷酸（分析純，北京化學(xué)試劑公司）；甲醇（分析純，北京化學(xué)試劑公司）；二甲基亞砜（分析純，天津光復(fù)化學(xué)試劑公司）；實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

1.4 方法

1.4.1 樣品提取

臍橙去皮，將可食部分勻漿處理，稱(chēng)取5.0 g，按照1∶10（g/mL）料液比加入80%甲醇水和二甲基亞砜（v∶v=1 ∶1），超聲輔助提取，提取 30 min，過(guò)濾，濾渣重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，用80%甲醇水和二甲基亞砜（v∶v=1∶1）定容于100 mL容量瓶中，作為供試品溶液，使用前過(guò)0.45 μm濾膜。

1.4.2 色譜條件

色譜柱：色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A 相：0.1%磷酸水；B 相：乙腈，梯度洗脫：梯度洗脫，A相：0.1%磷酸水；B相：乙腈，洗脫程序：23%B 等度（0～5 min）；23%～55%B 線性變換（5 min～10 min）；55%B 等度（10 min～25 min）；檢測(cè)波長(zhǎng)：波長(zhǎng)切換技術(shù)，0～13 min：285 nm；13 min～25 min：210 nm。柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

1.4.3.1 單一標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱(chēng)取柚皮苷、橙皮苷、檸檬苦素、諾米林各4.0 mg分別置于25 mL容量瓶中，橙皮素、柚皮素各4.0 mg分別置于100 mL容量瓶中，用80%甲醇水和二甲基亞砜（v∶v=1∶1）溶解，配制成濃度分別為160、40 μg/mL 單一標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱(chēng)取柚皮苷、橙皮苷、檸檬苦素、諾米林各8.0 mg，橙皮素、柚皮素各2.0 mg分別置于500 mL容量瓶中，用80%甲醇水和二甲基亞砜（v∶v=1∶1）溶解，配制成與單標(biāo)濃度相同的混標(biāo)溶液。

1.4.4 系統(tǒng)適用性

取濃度分別為160.0、40.0 μg/mL的6種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)單標(biāo)、混標(biāo)溶液，分別量取10 μL注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣分析，采用單標(biāo)、混標(biāo)通過(guò)保留時(shí)間（±5%）及用標(biāo)樣增高法對(duì)待測(cè)樣品中的檢測(cè)成分進(jìn)行定性分析，以對(duì)稱(chēng)因子為指標(biāo)，考察色譜系統(tǒng)適用性。

1.4.5 線性與范圍

按1.4.3.2項(xiàng)下方法配制混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密吸取 0.1、1、3、5、7、10 mL 至 10 mL 容量瓶中，并用 80%甲醇水和二甲基亞砜（v∶v=1∶1）的溶液定容至刻度，獲得6個(gè)不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取10 μL注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣分析。

1.4.6 精密度試驗(yàn)

量取濃度分別為160 μg/mL（柚皮苷、橙皮苷、檸檬苦素、諾米林）及40 μg/mL（橙皮素、柚皮素）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL注入高效液相色譜儀，按1.4.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，重復(fù)進(jìn)樣5次，以色譜峰面積為指標(biāo)考察儀器精密度。

1.4.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取1#贛南臍橙5 g，加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 mL，按照1.4.1項(xiàng)下方法提取，獲得供試品溶液，分別量取10 μL注入高效液相色譜儀，按1.4.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算6份樣品峰面積的RSD值，考察重復(fù)性試驗(yàn)。

1.4.8 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份對(duì)照品溶液，室溫靜置，分別于第0、2、4、6、8、12、24 h，量取 10 μL 注入高效液相色譜儀，按1.4.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，分別計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)色譜峰面積的RSD值，考察樣品溶液穩(wěn)定性。

1.4.9 回收率試驗(yàn)

取濃度分別為160 μg/mL（柚皮苷、橙皮苷、檸檬苦素、諾米林）及40 μg/mL（橙皮素、柚皮素）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋100倍作為小標(biāo)溶液，按外標(biāo)法計(jì)算獲得1#贛南臍橙中該6種功效成分的含量，均勻取樣3份，每份5 g，分別定量加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液5.0 mL，按照1.4.1項(xiàng)下方法提取，量取10 μL注入高效液相色譜儀，按1.4.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定樣品的回收率。

1.4.10 定量限與檢測(cè)限

按1.4.3.1項(xiàng)下方法配置單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用逐級(jí)稀釋法，按S/N為10計(jì)算定量限（LOQ），按照S/N=3計(jì)算檢測(cè)限（LOD）。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性

臍橙中6種功效成分HPLC檢測(cè)色譜圖見(jiàn)圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standards and samples

結(jié)果表明，6種標(biāo)準(zhǔn)品在16 min內(nèi)能完全分離，且理論塔板數(shù)均＞ 3000，分離度R均＞1.5，各目標(biāo)物質(zhì)峰的對(duì)稱(chēng)性也較好，各標(biāo)準(zhǔn)品化合物的保留時(shí)間具有較好的重現(xiàn)性（±5%）。

2.2 線性與范圍

以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)（X），以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù) R2。結(jié)果表明，在濃度 2 μg/mL～266 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林等6種成分均具有良好的線性，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 6種功效成分化合物的線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear ranges，regression equations and correlation coefficients of 6 functional components

2.3 精密度

6種標(biāo)準(zhǔn)品柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林5次重復(fù)進(jìn)樣峰面積RSD值分別為0.68%、0.94%、0.29%、0.29%、0.62%、0.16%，均＜2%，結(jié)果表明精密度良好。

2.4 重現(xiàn)性

6份樣品6種對(duì)照品柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林峰面積的RSD值分別為：0.37%、0.59%、0.77%、0.58%、0.94%、0.56%，均＜2%，表明重復(fù)性良好。

2.5 溶液穩(wěn)定性

6種標(biāo)準(zhǔn)品柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林24 h內(nèi)峰面積RSD值分別為1.62%、0.37%、1.43%、0.91%、1.25%、1.38%，均＜2%，表明6種功效成分在24 h內(nèi)溶液穩(wěn)定性良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

6種功效成分的平均回收率在94.6%～111.9%，結(jié)果表明6種功效成分均具有良好的回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率檢測(cè)結(jié)果Table 2 Recoveries of the 6 kinds of functional components

2.7 定量限與檢測(cè)限

經(jīng)計(jì)算，柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林的定量限分別為 1.59、0.74、0.62、0.40、0.47、4.77 ng；檢測(cè)限分別為：0.48、0.22、0.18、0.12、0.14、1.43 ng。

2.8 含量測(cè)定

1#贛南臍橙、2#秭歸臍橙、3#新奇士臍橙樣品的含量結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 臍橙中功效成分含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of functional components in navel orange mg/kg

結(jié)果表明3種臍橙中黃酮類(lèi)物質(zhì)中含量最高為橙皮苷，順序?yàn)橼M南臍橙＞秭歸臍橙＞新奇士臍橙，其中贛南臍橙高達(dá) 3302.3 mg/kg，3種臍橙中新奇士臍橙中檸檬苦素含量較高，達(dá)到176.64 mg/kg，秭歸臍橙中諾米林含量較高，達(dá)到125.3 mg/kg。

3 結(jié)論與討論

3.1 樣品的提取制備

目前黃酮類(lèi)物質(zhì)提取超聲輔助提取法采用較多，均已取得較高的提取率[7，9-10]；本論文選擇超聲輔助提取，考慮到檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)特殊的溶解性能。選80%甲醇水和二甲基亞砜（v∶v=1∶1）為提取溶劑，采用四因素三水平（提取液體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)）正交試驗(yàn)，確定最佳提取方法：80%甲醇和二甲基亞砜（v∶v=1∶1），超聲提取時(shí)間 30 min，料液比1∶10，提取次數(shù)2次。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

利用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)6種功效成分進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示：柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素在285 nm波長(zhǎng)均有最大特征紫外吸收，檸檬苦素、諾米林在200 nm～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)沒(méi)有特征紫外吸收，為末端吸收，經(jīng)HPLC方法學(xué)考察，本論文最終選擇雙波長(zhǎng)切換技術(shù)，使得各種化合物均在其最大紫外吸收波下檢測(cè)，其色譜響應(yīng)值最大，獲得了滿(mǎn)意的結(jié)果。

3.3 流動(dòng)相的選擇

由于選擇的6種功效成分結(jié)構(gòu)類(lèi)型差異較大，等度洗脫分析時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致色譜峰柱效降低，為提高柱效節(jié)約時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)選擇梯度洗脫程序。流動(dòng)相分別實(shí)驗(yàn)了乙腈、甲醇與0.05%、0.1%、0.5%三個(gè)不同濃度的甲酸水、磷酸水的不同配比，考察了流動(dòng)相對(duì)樣品分離度及柱效的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙腈、甲醇均可實(shí)現(xiàn)6種功能成分的分離，但乙腈洗脫能力較強(qiáng)，可節(jié)約時(shí)間，提高柱效，故選擇乙腈為有機(jī)相。水相中酸的加入可有效抑制化合物色譜峰的拖尾現(xiàn)象，改善色譜峰峰型，提高色譜峰對(duì)稱(chēng)性，但流動(dòng)相的pH過(guò)低會(huì)降低色譜柱的使用壽命，綜合考慮色譜峰柱效及色譜柱的pH耐受范圍，選擇0.1%磷酸水為水相，對(duì)該6種黃酮類(lèi)和檸檬苦素類(lèi)化合物在16 min內(nèi)均達(dá)到基線分離，且均具有較高的柱效。

3.4 結(jié)論

本論文建立了同時(shí)檢測(cè)4種黃酮類(lèi)功效成分（柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素）及2種檸檬苦素類(lèi)功效成分（檸檬苦素、諾米林）的RP-HPLC檢測(cè)方法，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，建立的方法可靠、準(zhǔn)確，可用于臍橙類(lèi)水果中柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林等6種功效成分的含量測(cè)定。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005：132

[2] 賈冬英,姚開(kāi),譚敏,等.柚果皮中生理活性成分研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2002,27(11)：74-77

[3] 吳桂蘋(píng),蘇學(xué)素,焦必寧,等.柑橘活性成分檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)2006,32(9)：116-117

[4] Nogata Y,Sakamoto K,Shiratsuchi H,et al.Flavonoid composition of fruit tissues of citrus species[J].Bioscience,Biotechnology and Biochemistry,2006,70(1)：178-192

[5] GoulasV,Manganaris G A.Exploring the phytochemical content and the antioxidant potential of citrus fruits grown in Cyprus[J].Food Chemistry,2012,131：39-47

[6] Ramful D,Tarnus E,Aruoma O I,et al.Polyphenol composition,vitamin C content and antioxidant capacity of Mauritian citrus fruit pulp[J].Food Research International,2011,44(7)：2088-2099

[7] 徐維盛,李東,劉靜,等.果酒中11種酚類(lèi)化合物反相高效液相色譜檢測(cè)方法的建立[J].衛(wèi)生研究,2013,42(3)：163-170

[8] 劉亮,戚向陽(yáng),董緒燕,等.高效液相色譜法測(cè)定柑橘中的檸檬苦素類(lèi)似物[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2007,34(4)：130-132

[9] 孫崇德,陳昆松,陳青俊,等.柑桔果實(shí)中天然檸檬苦素和諾米林的提取、鑒別與檢測(cè)[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2004,4(1)：7-10

[10]廖春燕,朱海東.超聲波法提取橘皮中黃酮物質(zhì)的研究[J].四川食品與發(fā)酵,2007,43(3)：32-34

[11]李志輝,肖暉,孟軍華,等.超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定柑橘屬類(lèi)藥材中4種黃酮類(lèi)成分[J]中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2012,32(20)：1683-1684

[12]孟鵬,鄭寶東.超高效液相色譜法快速并同時(shí)檢測(cè)金柑中檸檬苦素和諾米林[J]中國(guó)食品學(xué)報(bào),2013,12(2)：17-18

[13]周大勇,徐青,薛興亞,等.高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法測(cè)定枳殼中黃酮苷類(lèi)化合物[J].分析化學(xué),2006,34(特刊)：31-35

[14]Manners G D,Breksa A P,Schoch T K,et al.Analysis of bitter limonoids in citrus juices by atmospheric pressure chemical ionozation and electrospray ionization liquid chro-matography-mass spectrometry[J].J Agric Food Chem,2003,51(6)：3709-3714

[15]賈強(qiáng),白楊,馬燕,等.枳殼和枳實(shí)化學(xué)成分的HPLC-ESI-MS分析[J]中草藥,2005,36(2)：169-172

[16]胡靈.玉環(huán)柚柚皮中黃酮類(lèi)化合物提取-分離及指紋圖譜的研究[D]浙江工業(yè)大學(xué),2011(4)：59-64