肖仔君，陸偉東，張吉剛，林麗芳

（1.韶關(guān)學(xué)院 英東食品學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005；2.韶關(guān)學(xué)院 化學(xué)與土木工程學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005；3.麗珠集團(tuán)利民制藥廠，廣東 韶關(guān) 512028；4.韶關(guān)市紫背桃源生態(tài)科技有限公司，廣東 韶關(guān) 512000）

沙田柚屬蕓香科柑橘屬喬木柚樹的果實(shí)，含有較多營養(yǎng)成分［1］.目前沙田柚果汁加工工藝成熟，但柚汁由于加工后苦味明顯，仍處在脫苦初步研究階段，常見的脫苦方法主要有包埋法、吸附法、酶法等［2］.

檸檬苦素類物質(zhì)是一類具有呋喃環(huán)的三萜類次生代謝產(chǎn)物，主要存在于柑橘屬植物果實(shí)中，以柚皮柚核中含量最多，含量1%左右［3］.類檸檬苦素是柚皮和柚核中的主要活性物質(zhì)之一.類檸檬苦素常以兩種形式存在，一種為類檸檬苦素苷元，另一種為類檸檬苦素配糖體［4］，苷元是使柑橘類果汁產(chǎn)生后苦現(xiàn)象的重要原因之一.產(chǎn)生后苦現(xiàn)象的柚子汁嚴(yán)重降低了柚汁的食用品質(zhì)和商用價值，極大地限制了柚子深加工產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展.為了降低柚汁中檸檬苦素的含量，國內(nèi)外學(xué)者提出和試驗(yàn)了多種降低柚汁檸檬苦素的方法.目前，已報道的主要柚汁檸檬苦素脫除方法有代謝脫苦［5］、屏蔽脫苦［6］、超臨界 CO2脫苦［7］、β- 環(huán)糊精［8］、吸附脫苦［9-10］、酶法脫苦［11-12］等.吸附脫苦及掩飾脫苦是目前生產(chǎn)上常用的脫除檸檬苦素的方法，但吸附法容易造成柚汁其它營養(yǎng)物質(zhì)（如VC）損失，且吸附劑易飽和、再生困難.而掩飾法脫苦效果不穩(wěn)定［11］.酶法脫除檸檬苦素主要是通過不同的微生物發(fā)酵液或酶來分解檸檬苦素，生成不含苦味的物質(zhì).因此酶法脫苦不會破壞柚汁的風(fēng)味和營養(yǎng)成分，且脫苦效果好，成本低，具有無毒性、效率高、反應(yīng)條件溫和及催化活力可被調(diào)節(jié)控制等優(yōu)勢［12-13］.

但由于商品酶高昂的價格，限制了酶法脫苦在柚子深加工產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用.因此，本研究通過從本地產(chǎn)柚子（粵北長壩沙田柚）中分離出的黑曲霉（Aspergillus niger）用于制作發(fā)酵粗酶液，分別采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察黑曲霉發(fā)酵粗酶液（以下簡稱粗酶液）對柚子汁中檸檬苦素的去除效率，以尋求開發(fā)成本低廉的酶法脫除柚汁檸檬苦素方法，為粵北長壩沙田柚深加工提供技術(shù)支持.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

長壩沙田柚購自某農(nóng)貿(mào)市場，黑曲霉從長壩沙田柚中分離而得，分離所得黑曲霉貯存于英東食品學(xué)院微生物室.粗酶液通過培養(yǎng)該黑曲霉而得，經(jīng)測定粗酶液的活性為1.09 U.實(shí)驗(yàn)過程中使用的主要化學(xué)試劑有三氯化鐵、硫酸、無水乙醇、4-（二甲氨基）苯甲醛、石油醚、三氯甲烷和七水硫酸鎂等，均為分析純.

主要的實(shí)驗(yàn)儀器有可見分光光度計(jì)（722，上海市佑科儀器儀表有限公司）、振蕩培養(yǎng)箱（PYX-250Z-B，廣州科力儀器）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4，常州市金壇友聯(lián)儀器研究所）等.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線

檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按文獻(xiàn)［14］所述進(jìn)行.本實(shí)驗(yàn)測得檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示.

圖1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2 樣品中檸檬苦素的測定

檸檬苦素的定量分析采用對二-甲氨基苯甲醛比色法［15］.粗酶液對柚汁中檸檬苦素脫除效果的評價，以柚汁中檸檬苦素的減少量表示.在粗酶液的作用下，柚汁中檸檬苦素減少越多，脫苦率越大，脫苦效果就越好.脫苦率計(jì)算方式為式中，D為檸檬苦素脫除率；C0為柚汁中檸檬苦素含量；C1為粗酶液處理后柚汁中檸檬苦素含量.

1.2.3 酶活的測定

稀釋檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量-體積濃度為150 μg/mL.在粗酶液用量0.4 mL，溫度45 ℃，pH值為6.0的條件下酶解2 h，根據(jù)檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出酶解后的檸檬苦素的含量.通過公式：酶活力=（X標(biāo)-X樣）×N/t，計(jì)算出酶活力［16］，式中（X標(biāo)-X樣）為黑曲霉發(fā)酵液水解檸檬苦素的微克數(shù)；t為酶解時間；N為柚苷酶樣品的稀釋倍數(shù)0.4.

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

固定粗酶液量0.4 mL、酶解溫度45 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為100 rpm、酶解時間為2 h條件下，考察柚汁pH分別為3、4、5、6和7時，粗酶液對柚汁中檸檬苦素脫除率；固定粗酶液量0.4 mL、酶解溫度45 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為100 rpm、柚汁pH為6條件下，考察酶解時間分別為1.5、2.0、2.5、3.0和3.5 h時，柚汁中檸檬苦素脫除率；固定酶解溫度45 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為100 rpm、酶解時間為2 h和pH為6條件下，考察粗酶液添加量分別為0.2、0.4、0.6、0.8和1.2 mL時柚汁檸檬苦素脫除率；固定粗酶液量0.4 mL、pH為6、搖床轉(zhuǎn)速為100 rpm、酶解時間為2.0 h條件下，酶解溫度分別在25、35、45、55和65 ℃條件下柚汁檸檬苦素脫除率.

1.2.5 正交試驗(yàn)

通過單因素實(shí)驗(yàn)，篩選出對柚汁檸檬苦素脫除率影響最為顯著的3個因素，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，見表1，以優(yōu)化粗酶液對柚汁中檸檬苦素脫除工藝的參數(shù).

表1 L9（33）正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

本研究中所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果.實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過 Excel 2010 計(jì)算獲得，并采用 Origin pro 9.0（Origin Lab，USA）繪制各實(shí)驗(yàn)因素對柚汁中檸檬苦素脫除率的影響曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同pH條件下粗酶液對柚汁脫苦的影響

由圖2可以看出，在pH值低于5時，柚汁中檸檬苦素脫除率隨著pH值的升高而增大.當(dāng)pH值為6，檸檬苦素脫除率達(dá)到36.8%，但pH值對柚汁檸檬苦素脫除率的影響不顯著.本研究中檸檬苦素的脫除率低于張錦華等人采用檸檬苦素降解菌C6（Raoultella ornithinolytica）脫除柑橘汁中檸檬苦素的脫除率（91.28%），但處理時間為 12 h［17］.當(dāng) pH 高于6時，隨著pH值的增大，檸檬苦素脫除率顯著降低，其可能原因主要在于pH直接影響酶蛋白的構(gòu)象，或影響底物和酶活性中心部位基團(tuán)的解離，進(jìn)而影響酶反應(yīng)的速度，甚至導(dǎo)致柚苷酶變性而失活［18］.因此本研究中粗酶液對柚汁檸檬苦素脫除率在柚汁pH值為6時較佳.

2.2 不同酶解時間對柚汁脫苦的影響

如圖3所示，隨著酶解時間的延長，檸檬苦素脫除率增大，而在2.0 h后隨著時間的延長，脫除率增加不顯著，其主要原因是粗酶液中酶解檸檬苦素的酶活性較低，酶解時間超過2.0 h時酶基本消耗完全.故粗酶液對柚汁進(jìn)行脫苦時，從節(jié)省能源，減少生產(chǎn)周期考慮，酶解時間以2.0 h左右為宜.

圖3 酶解時間對檸檬苦素脫除效果的影響

2.3 不同粗酶液對柚汁脫苦的影響

由圖4可知，柚汁的脫苦率先隨著粗酶液的添加量的增加而增高，在添加量為0.4 mL時脫除率達(dá)到最大值43.5%，低于黃穎穎等人采用商品柚苷酶制劑對琯溪蜜柚汁中的檸檬苦素的脫除率（87.09%）［19］，這是由于本實(shí)驗(yàn)用的酶是粗酶液，未進(jìn)行酶的純化，其濃度不高.本試驗(yàn)為了探求粗酶液對檸檬苦素脫苦的效果，后續(xù)的試驗(yàn)會將酶液進(jìn)行純化，提高其生產(chǎn)的利用效率.但當(dāng)粗酶液的添加量高于0.4 mL后隨著添加量的增加脫除率先下降較快后減慢趨于平緩，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因是在柚汁脫苦加工處理過程中，黑曲霉的的培養(yǎng)基中含有柚皮粉，故其粗酶液中有苦味物質(zhì).因此，粗酶液的添加量為0.4 mL時，檸檬苦素的脫除率最大.

圖4 粗酶液添加量對檸檬苦素脫除效率的影響

2.4 不同酶解溫度對柚汁脫苦的影響

由圖5可知，在溫度25~45 ℃時，檸檬苦素的脫除率隨著溫度的上升而增大，脫苦率雖有所上升，但不顯著，而在酶解溫度為55 ℃時，檸檬苦素脫除率明顯增大并達(dá)到最大值，而后脫除率隨著酶解溫度的上升而快速降低.主要原因是由于在較低溫時隨著溫度的上升，酶活增大.但溫度過高會使酶活性減弱、酶的穩(wěn)定性降低，甚至?xí)茐拿冈镜慕Y(jié)構(gòu)，引起變性［20］.故最佳酶解溫度為55 ℃左右.

圖5 酶解溫度對檸檬苦素脫除效果的影響

2.5 正交實(shí)驗(yàn)

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，柚汁pH、酶解時間、粗酶液添加量以及酶解的溫度均對柚汁脫苦有影響，但影響程度不同（脫苦率在5%~41%之間）.柚汁pH的對柚汁中檸檬苦素脫苦效率的影響不明顯.故在正交試驗(yàn)中，選擇酶解時間、粗酶液添加量以及酶解的溫度作為實(shí)驗(yàn)的因素.表2為粗酶液對柚汁中檸檬苦素脫苦工藝參數(shù)優(yōu)化的結(jié)果.由表2可知，對于檸檬苦素脫除率，影響試驗(yàn)結(jié)果的主次順序?yàn)镃＞A＞B，最適組合為A2B3C2，即粗酶液對柚汁中檸檬苦素脫苦工藝的最適參數(shù)為酶液添加量為0.4 mL，酶解時間為3.5 h，柚汁溫度為55 ℃.

表2 粗酶液對柑橘類果汁中檸檬苦素脫除的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)過添加0.4 mL粗酶液，酶解溫度為55 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為100 rpm和酶解時間為3.5 h的條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得的檸檬苦素脫除率為42.0%，與預(yù)測結(jié)果相比差異不顯著.

3 結(jié)論

本文分離產(chǎn)自本地沙田柚的黑曲霉，并成功用于產(chǎn)酶和對粵北長壩柚汁進(jìn)行脫苦試驗(yàn).結(jié)果表明粗酶液具有成本低廉及對柚汁中檸檬苦素具有較好的脫除效率的特點(diǎn).在柚汁溫度為55 ℃，酶解時間為3.5 h和粗酶液添加量為0.4 mL的條件下，對柚汁檸檬苦素的脫除率達(dá)41.9%，具有替代商品柚苷酶用于柑橘果汁脫苦的巨大應(yīng)用潛力.但本研究中粗酶液未進(jìn)行純化，在后續(xù)的試驗(yàn)中可以通過純化，提高其純度以提高酶的脫苦率，并進(jìn)一步明確酶液的主要活性成分.此外，由于柚子品種繁多，生長條件差異較大，所含苦味素成分及其含量也參差不齊.因此，黑曲霉產(chǎn)酶液對其它柑橘類果汁飲料的脫苦效率和適應(yīng)性仍有待于進(jìn)一步研究.