張粉麗，陳 兵，薛整風(fēng),李 怡

(1. 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京，江蘇 210046；2.揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，揚(yáng)州，江蘇 225009)

ENU是目前公認(rèn)的最強(qiáng)的小鼠誘變劑,其誘導(dǎo)的突變分為顯性、隱性或沉默突變，顯性突變的篩查比較簡(jiǎn)單，G0代雄性小鼠精原細(xì)胞中所攜帶的突變就可以在G1代小鼠中出現(xiàn)對(duì)應(yīng)表型；隱性突變的篩查十分復(fù)雜，因?yàn)閴A基的突變?cè)贕1小鼠中不出現(xiàn)相應(yīng)的表型，研究者需要對(duì)G1小鼠采取一定的交配手段，使得可能存在的(無(wú)突變表型)突變基因純合，才能發(fā)現(xiàn)新的表型。ENU誘變劑誘導(dǎo)突變作為一種表型驅(qū)動(dòng)法可以通過(guò)篩選獲得并建立人類疾病相似的動(dòng)物模型，同時(shí)也可以進(jìn)行基因功能的分析[1，2]。

2003年，通過(guò)ENU誘變小鼠揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心篩選到6種白斑突變小鼠，其中一種C57BL/6J小鼠的腹部、爪子以及尾部出現(xiàn)白斑突變，被命名為Wbct[3](white belly, claws and tails)。在Wbct小鼠保種過(guò)程中出現(xiàn)了一種新表型突變小鼠——卷尾白斑突變小鼠，但是這種突變小鼠與正常B6小鼠回交后，白斑表型消失，卷尾表型能夠遺傳下去。因此我們獲得了一例只有卷尾(loop-tail, LP)而無(wú)白斑的B6突變小鼠。

本研究確定了LP小鼠的遺傳模式，并對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行了精確定位，篩選到了卷尾突變表型的強(qiáng)力候選基因—Vangl2。通過(guò)對(duì)Vangl2部分基因序列的測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了該基因的一個(gè)新突變位點(diǎn)，為Vangl2基因功能的深入研究及建立相應(yīng)的動(dòng)物模型打下了基礎(chǔ)[4]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

正常C57BL/6J(B6)、C3He/J(C3H)小鼠，卷尾突變小鼠由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2012-0004，動(dòng)物飼養(yǎng)在屏障環(huán)境的動(dòng)物房?jī)?nèi)，飼料(江蘇協(xié)同醫(yī)藥公司生產(chǎn))采用60Co照射，自由采食和飲水，室內(nèi)溫度控制在(23±2)℃，濕度控制在(55±5)%，室內(nèi)照明采用12 h:12 h明暗交替。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(蘇)2012-0029

1.2 試劑及儀器

蛋白酶K，動(dòng)物組織消化液，TRIzol reagent, Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit, LA Taq, QIA quick Gel Exaction Kit, PCR儀，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)，常溫離心機(jī)，冷凍離心機(jī)，超凈工作臺(tái)，電熱恒溫水槽。

1.3 方法

1.3.1 確定LP小鼠的遺傳模式：將B6背景的LP雄鼠與正常B6, C3H雌鼠各12只交配，記錄G1代中LP小鼠與正常小鼠的數(shù)目。

1.3.2 N2代LP小鼠的獲得及N2代小鼠基因組DNA提?。簩6背景的LP小鼠與正常C3H小鼠交配，獲得F1代LP小鼠，再將F1代小鼠與正常B6小鼠交配獲得[(B6×C3H)F1×B6]N2代LP小鼠。剪取N2代LP小鼠尾尖0.5 cm左右，常規(guī)蛋白酶K消化，酚氯仿方法提取基因組DNA[5]。

1.3.3 連鎖分析：通過(guò)微衛(wèi)星引物D1Mit113和D1Mit149 PCR擴(kuò)增N2代LP小鼠基因組DNA。記錄并計(jì)算突變基因與微衛(wèi)星之間的重組率，采用基因連鎖分析以確定突變基因在1號(hào)染色體上的位置。

1.3.4 候選基因Vangl2序列分析：提取LP小鼠及正常B6小鼠尾DNA, PCR擴(kuò)增Vangl2基因的外顯子以及側(cè)翼區(qū)，膠回收后測(cè)序。用DNAstar軟件將LP小鼠測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中及正常B6小鼠的Vangl2序列比對(duì)，或者分析LP小鼠測(cè)序峰圖中是否出現(xiàn)明顯重疊波并選擇不同突變個(gè)體重復(fù)測(cè)序1次驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。引物序列為：

Vangl2-452 Forward: 5′-AAACACCCTAGCTATC TTAGAAAGC-3′

Vangl2-452 Reverse: 5′-GGAAGTAGGACTGGC AGAAATGTG-3′;

Vangl2-324 Forward: 5′-TAGGATGAGCAGTGA GCACCTGCG-3′

Vangl2-324 Reverse: 5′-GACAAGAAGCTGGAC AGAGAGGAC-3′;

Vangl2-908 Forward: 5′-ACCTGCCCTGATGTGT CCCTTC-3′

Vangl2-908 Reverse: 5′-GCTTTCTCAGCCCAGT TCATCC-3′。

1.3.5 胚胎總RNA提取及RT-PCR：LP小鼠互交后檢栓，E12.5 d脫頸椎處死，取胚胎頭部于1000μLTrizol變性液中研磨，氯仿、異丙醇抽提獲得總RNA,立即用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄。以cDNA模板進(jìn)行為RT-PCR,PCR產(chǎn)物回收并測(cè)序。最適宜退火溫度為61℃，引物序列Forward:5′-TACTACGAGGAAG CCGAGCATGA-3′; Reverse:5′-GCAGCCGCATGA CGAACTTATGT-3′。

1.3.6 基因型分析：提取LP小鼠互交后E12.5 d胚胎DNA, PCR擴(kuò)增Vangl2基因中包含點(diǎn)突變的基因片段(452bp)，引物序列Vangl2-452 Forward:5′-AAACACCCTAGCTATCTTAGAAAGC-3′; Vangl2-452 Reverse:5′-GGAAGTAGGACTGGCAGAAATGTG-3′。FspBI(BfaI)內(nèi)切酶將PCR產(chǎn)物37℃酶切12h,酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳。野生型正常小鼠，顯示一條帶(452 bp)；突變雜合子小鼠，顯示三條帶(分別為452 bp、319 bp、133 bp)；突變純合子小鼠，顯示兩條帶(分別為319 bp、133 bp)。

2 結(jié)果

2.1 LP小鼠遺傳模式及表現(xiàn)型分析

LP小鼠與正常B6小鼠回交獲得103只小鼠，出現(xiàn)LP表型的后代32只。LP與正常C3H小鼠雜交獲得后代36只，有LP表型的僅1只。提示該突變基因表型與背景品系有關(guān)，同時(shí)表明LP小鼠的遺傳模式為單基因不完全顯性遺傳，外顯率不完全。

2.2 LP小鼠突變基因的定位及候選基因的確定

用微衛(wèi)星D1Mit113(距著絲粒79.54 cM)和D1Mit149(距著絲粒80.13 cM)對(duì)42個(gè)N2代小鼠DNA樣品進(jìn)行連鎖分析，結(jié)果顯示D1Mit113與突變基因重組0例，重組率為0；D1Mit149與突變基因重組0例，重組率為0。對(duì)附近逐個(gè)基因功能分析發(fā)現(xiàn)距著絲粒79.54 cM的Vangl2基因突變表型[6]與本例小鼠表型極為相似，因此Vangl2基因?yàn)長(zhǎng)P突變表型的強(qiáng)力候選基因(圖1)。

圖1 突變基因在小鼠第1號(hào)染色體上的位置

2.3 Vangl2基因的測(cè)序結(jié)果及蛋白預(yù)測(cè)

PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，與正常B6小鼠Vangl2基因序列相比，LP小鼠的Vangl2基因第8外顯子出現(xiàn)單堿基突變，即在Vangl2基因編碼區(qū)1345bp處堿基由C→T(圖2A, B)。該突變導(dǎo)致純合子小鼠編碼的蛋白449位點(diǎn)出現(xiàn)無(wú)義突變CAG→TAG(圖2C)，同時(shí)C→T堿基突變?cè)诖水a(chǎn)生了一個(gè)FspBI(BfaI)內(nèi)切酶位點(diǎn)。

LP雜合子小鼠RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示，突變等位基因能夠被轉(zhuǎn)錄、拼接，而不是無(wú)義降解，但是可能會(huì)導(dǎo)致編碼蛋白的部分功能喪失(圖2D)。

(A) 局部Vangl2基因組DNA測(cè)序結(jié)果(B)Vangl2 基因部分外顯子與內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖(C)蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果(紅色字體為堿基突變位點(diǎn))(D)LP雜合子小鼠RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

2.4 LP小鼠基因型分析結(jié)果

3對(duì)LP小鼠互交后獲得28只E12.5d胎鼠，胎鼠基因組DNA經(jīng)FspBⅠ(BfaⅠ)酶切、電泳后出現(xiàn)三種不同大小的條帶，由電泳條帶可以鑒定出互交后代的基因型(圖3)。

注：+/+為野生型正常小鼠，顯示一條帶(452bp)；+/-為突變雜合子小鼠，顯示三條帶(分別為452bp、319bp、133bp)；-/-為突變純合子小鼠，顯示兩條帶(分別為319bp、133bp)

3 討論

ENU誘變小鼠是分子遺傳學(xué)、基因組學(xué)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)間的交叉。ENU誘變能夠獲得功能基因研究的新材料，即獲得人類遺傳性疾病的動(dòng)物模型[7-9]，在定位克隆突變基因的基礎(chǔ)上，研究突變基因的功能，并用于研究疾病的發(fā)生機(jī)制及進(jìn)行治療藥物的開發(fā)。通過(guò)模式小鼠研究功能基因或人類疾病，有可能會(huì)成為一種最有前景的手段和途徑[10]。本研究中利用ENU誘變獲得的1例卷尾突變小鼠，在先前初步定位工作的基礎(chǔ)上對(duì)突變基因精確定位，最終確定該卷尾突變表型是由Vangl2基因無(wú)義突變引起。

本研究中發(fā)LP純合子胚胎從后腦到尾端的神經(jīng)管都是開放的，引起嚴(yán)重的神經(jīng)管缺陷(neural tube defects, NTD)——顱脊柱裂(craniorachischisis)[11-13]。在鑒定LP小鼠雜交后代基因型中發(fā)現(xiàn)沒有純合子出生，純合子在胚胎期出現(xiàn)顱脊柱裂，并且死于子宮中。因此我們發(fā)現(xiàn)的LP突變純合子小鼠可以作為研究人類NTDs疾病的模型。

目前已報(bào)道的卷尾小鼠突變表型有三種：自然突變的LP和化學(xué)誘變的Lpm1Jus, Lpm2Jus三種突變位點(diǎn)分別是Vangl2S464N、Vangl2E255D、Vangl2R259L[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)的是一種由ENU誘導(dǎo)的新的LP突變，突變發(fā)生在Vangl2基因編碼蛋白的449位點(diǎn)，是一種無(wú)義突變，引起蛋白編碼的提前終止，是導(dǎo)致卷尾突變表型的原因。若Vangl2突變基因可以轉(zhuǎn)錄，將產(chǎn)生一種損傷的、只含有448個(gè)氨基酸的蛋白，而Vangl2基因編碼后的蛋白共有521個(gè)氨基酸。我們預(yù)測(cè)這種無(wú)義突變可能導(dǎo)致編碼后蛋白的某些功能喪失，因此該突變是深入研究Vangl2基因功能良好的材料。

Vangl2基因(也被稱為L(zhǎng)PP1、Stbm)編碼膜蛋白，它的蛋白結(jié)構(gòu)包括4個(gè)跨膜蛋白(TM)區(qū)域和C末端PDZ結(jié)構(gòu)域，PDZ結(jié)構(gòu)域參與蛋白間的相互作用(Torban et al.,2004)。本研究中Vangl2基因1345bp處堿基C→T的突變，可能引起編碼后蛋白C末端PDZ結(jié)構(gòu)域的缺失，從而導(dǎo)致卷尾表型的發(fā)生。Vangl2基因編碼的蛋白屬于一類高度保守的平面細(xì)胞極化蛋白(planar cell polarity,PCP)[17-18]，參與非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路[19-20]，該信號(hào)通路的紊亂將會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞的侵襲以及NTDs的發(fā)生。人與小鼠的Vangl2基因在核苷酸水平有近89%的同源性，在氨基酸水平有99%的同源性。因此了解Vangl2基因的各種作用機(jī)理將會(huì)為未來(lái)治療人類NTDs奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Balling R. ENU mutagenesis: analyzing gene function in mice[J]. Annu Rev Genom Human Genet, 2001, 2: 463-492.

[2] 傅繼梁.值得關(guān)注的小鼠ENU誘變研究[J].科學(xué)通報(bào), 2003,48(22): 2299-2300.

[3] 徐向明,王琳,翟國(guó)琴, 等. Pax3基因無(wú)義突變導(dǎo)致Wbct小鼠顯性白斑形成[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008, 24(6): 857-861.

[4] Montcouquiol M, Rachel RA, Lanford PJ,et al. Identification of Vangl2 and Scrb1 as planar polarity genes in mammals[J].Nature,2003, 423:173-177.

[5] Joseph S, Russelld W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M ].第3版.北京:科學(xué)出版社, 2002: 479-483.

[6] Kibar Z, Underhill DA, Canonne-Hergaux F,et.al.Identification of a new chemically induced allele (Lpm1Jus) at the loop-tail locus:morphology,histology and genetic mapping[J]. Genomics,2001,72(3):331-337.

[7] Keays DA, larkTG, Flint J.Estimating the number of coding mutations in genotypic- and phenotypic-driven N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) screens[J].Mammalian Genome, 2006, 17(3):230-238.

[8] Enders A, Bergmann H, Yabas M, et al.Finding new immune regulatory genes by ENU mutagenesis[J].J Transl Med, 2012, 10(Suppl 3):16.

[9] Sabrautzki S, Rubio-Aliaga I,Hans W,et al.Erratum to:New mouse models for metabolic bone diseases generated by genome-wide ENU mutagenesis[J].Mamm Genome,2012, 23:416-430.

[10] Clark AT, Goldowitz D, Takahashi JS, et al. Implementing large-scale ENU mutagenesis screens in North America[J]. Genetica,2004, 122:51-64.

[11] Nakouzi GA, Nadeau JH.Does dietary folic acid supplementation in mouse NTD models affect neural tube development or gamete preference at fertilization?[J].BMC Genetics,2014,15:91.

[12] Quan HY,Ma T,Zhao XX,et al.Vinyl chloride monomer (VCM) induces high occurrence of neural tube defects in embryonic mouse brain during neurulation[J].Cell Mol Neurobiol ,2014,34:619-630.

[13] BassukAG,Kibar Z.Genetic basis of neural tube defects[J].Semin Pediatr Neurol,2009, 16:101-110.

[14] Strong LC, Hollander WF. Hereditary loop-tail in the house mouse accompanied by imperforate vagina and with lethal craniorachischisis when homozygous[J]. J. Hered,1949,40: 329-334.

[15] Guyot MC, Bosoi CM, Kharfallah F, et al. A novel hypomorphic Looptail allele at the planar cell polarity Vangl2 gene[J]. Dev. Dyn, 2011, 240: 839-849.

[16] Murdoch JN,Doudney K,Paternotte C,et al.Severe neural tube defects in the loop-tail mouse result from mutation of Lpp1,a novel gene involved in floor plate specification[J].HumMolGenet,2001,10:2593-2601.

[17] Warchol ME,Montcouquiol M.Maintained expression of the planar cell polarity molecule Vangl2 and reformation of hair cell orientation in the regenerating inner ear[J].J Assoc Res Laryngol,2010, 11: 395-406.

[18] Wu G, Huang XP, Hua YM,et al.Roles of planar cell polarity pathways in the development of neutral tube defects[J].J Biomedi Sci, 2011, 18:66.

[19] Yang YZ. Wnt signaling in development and disease[J].Cell & Biosci,2012, 2:14.

[20] May-Simera HL,Kelley MW.Cilia,Wnt signaling, and the cytoskeleton[J]. Cilia, 2012, 1:7.