馬志鵬，陳軍

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無(wú)義突變與“遺傳補(bǔ)償效應(yīng)”

馬志鵬，陳軍

浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生命系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058

“遺傳補(bǔ)償效應(yīng)”(genetic compensation response, GCR)是近年來(lái)在斑馬魚(yú)()中最先描述的一個(gè)遺傳現(xiàn)象，是指當(dāng)敲低某一個(gè)基因時(shí)有明顯的表型，但此基因的敲除遺傳突變體由于其他基因的上調(diào)反而沒(méi)有表型。這種基因敲低和敲除表型上的差異并非斑馬魚(yú)所獨(dú)有，在擬南芥()、小鼠()等模式生物中都觀察到此種現(xiàn)象。這種奇怪的現(xiàn)象一直困擾著基因功能研究。2019年4月3日，同時(shí)在線發(fā)表兩篇論文揭示了其中的奧秘，其中一篇來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室，另一篇來(lái)自于德國(guó)Stainier實(shí)驗(yàn)室。利用斑馬魚(yú)或小鼠培養(yǎng)細(xì)胞的不同基因的遺傳突變體為模型，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別證明無(wú)義突變與核酸序列同源性是激活遺傳補(bǔ)償效應(yīng)的兩個(gè)先決條件；無(wú)義mRNA介導(dǎo)的降解途徑參與激活遺傳補(bǔ)償效應(yīng)；同時(shí)還觀察到補(bǔ)償基因的高表達(dá)與其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處的組蛋白H3K4me3修飾相關(guān)。本文具體介紹了這兩篇研究論文中提出的“遺傳補(bǔ)償效應(yīng)”分子機(jī)制的異同，以期為克服遺傳補(bǔ)償效應(yīng)給基因功能研究帶來(lái)的障礙提供新的思路和方法。

遺傳補(bǔ)償效應(yīng)；無(wú)義mRNA介導(dǎo)的降解途徑；表觀遺傳學(xué)修飾

生命中的遺傳物質(zhì)DNA時(shí)時(shí)刻刻都會(huì)受到損傷的威脅，這些威脅有來(lái)自于內(nèi)在的因素，如細(xì)胞分裂、正常細(xì)胞代謝產(chǎn)生的活性氧；也有來(lái)自于外在因素，如紫外及離子輻射、化學(xué)誘變劑等。每個(gè)細(xì)胞的基因組DNA每天會(huì)遇到差不多104次損傷。DNA損傷會(huì)產(chǎn)生基因上的變異，這些變異在生命進(jìn)化中扮演著重要的角色。但其中很多變異會(huì)使編碼蛋白的基因失去功能，如果變異的基因功能非常重要，機(jī)體又不采取措施，它就不能存活，就失去了生命的意義。為了存活，機(jī)體就進(jìn)化出許多機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)基因突變這一狀況，其中之一就是“遺傳補(bǔ)償效應(yīng)”(genetic compensation response, GCR)[1,2]，即某一基因發(fā)生突變徹底失去功能后，機(jī)體會(huì)采取相應(yīng)的機(jī)制，提高其他基因的表達(dá)來(lái)代替這一基因的功能，從而能夠正常發(fā)育存活。但是，其背后的分子機(jī)制是什么？在此之前，還不得而知。2019年4月3日，同期在線發(fā)表兩篇論文：一篇來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室，另一篇來(lái)自于德國(guó)馬普研究所Stainier實(shí)驗(yàn)室，同時(shí)對(duì)此機(jī)制進(jìn)行了探討[3,4]。本文將根據(jù)這兩篇論文所報(bào)道的研究結(jié)果解讀遺傳補(bǔ)償效應(yīng)的分子機(jī)制。

1 無(wú)義mRNA降解途徑

DNA損傷會(huì)造成多種類(lèi)型的基因突變，包括錯(cuò)義突變、缺失突變、無(wú)義突變、染色體重排等。其中最嚴(yán)重的類(lèi)型之一就是無(wú)義突變，即提前終止密碼子突變(premature termination codon, PTC)。在細(xì)胞中，基因的表達(dá)受到嚴(yán)格的監(jiān)控。如果無(wú)義突變的mRNA繼續(xù)翻譯成蛋白質(zhì)，將會(huì)產(chǎn)生一個(gè)比正常野生型蛋白短一些的蛋白，通常這種短蛋白不僅沒(méi)有功能，反而在很多情況下會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生顯性負(fù)的作用。因此，真核生物進(jìn)化了一個(gè)mRNA質(zhì)量監(jiān)控體系，即無(wú)義mRNA介導(dǎo)的降解途徑(nonsense mRNA mediated decay pathway, NMD)[5,6]，就是當(dāng)某個(gè)基因發(fā)生無(wú)義突變時(shí)，該基因轉(zhuǎn)錄出來(lái)的無(wú)義mRNA就會(huì)被NMD降解途徑識(shí)別，并帶到核外進(jìn)行降解，以消除翻譯短蛋白對(duì)機(jī)體帶來(lái)的副作用。在NMD降解途徑中，首先上游移碼蛋白Upf3b與外顯子拼接復(fù)合體(exon-junction complex, EJC)結(jié)合，進(jìn)一步招募Upf1和Upf2，然后在細(xì)胞質(zhì)中介導(dǎo)無(wú)義mRNA降解[7~10]。有意思的是，進(jìn)化上與Upf3b蛋白高度同源的上游移碼蛋白3a (Upf3a)同樣可以與EJC結(jié)合，但在無(wú)義mRNA降解中作用并不明顯[11]。那么無(wú)義mRNA降解途徑是否參與基因補(bǔ)償效應(yīng)，是否存在新的生理功能？在這兩篇論文發(fā)表之前還沒(méi)有明確答案。

2 多個(gè)斑馬魚(yú)遺傳突變體具有遺傳補(bǔ)償效應(yīng)

幾年前，本實(shí)驗(yàn)室在研究斑馬魚(yú)一個(gè)鈣調(diào)蛋白酶Capn3a時(shí)觀察到采用寡聚嗎啉代核苷酸(morpholino)抑制蛋白翻譯敲低該基因，斑馬魚(yú)胚胎會(huì)出現(xiàn)小肝臟表型[12]。為了進(jìn)一步研究基因在肝臟發(fā)育中的功能，我們運(yùn)用TALEN方法[13]構(gòu)建了一個(gè)基因敲除突變體：突變后的轉(zhuǎn)錄本在第60個(gè)密碼子出現(xiàn)終止密碼子，即無(wú)義突變。令人疑惑的是，突變體發(fā)育正常，沒(méi)有表現(xiàn)出小肝臟的表型。因此，我們推測(cè)突變可能激活“遺傳補(bǔ)償效應(yīng)”。通過(guò)檢測(cè)該突變體中19個(gè)capn家族基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)多個(gè)家族基因上調(diào)，同時(shí)還證明突變體無(wú)表型是由于這些家族基因上調(diào)彌補(bǔ)其功能所致[4]。Stainier實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)、、和等基因敲除也會(huì)激活相應(yīng)的遺傳補(bǔ)償效應(yīng)。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室根據(jù)各自的遺傳突變體分別探討了遺傳補(bǔ)償效應(yīng)的分子機(jī)制，得出了相似但又有不同的結(jié)論，下面將逐一討論。

3 無(wú)義突變與核酸序列同源性是激活遺傳補(bǔ)償效應(yīng)的必要條件

為了證實(shí)是否只有無(wú)義突變才能激活補(bǔ)償效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)室采用CRISPR/Cas9方法構(gòu)建了多個(gè)遺傳突變體攜帶不同類(lèi)型的突變，如：同框缺失突變(缺失序列長(zhǎng)度是3倍數(shù))；不同位置無(wú)義突變；提前終止密碼子在最后一個(gè)外顯子上的突變。在另一項(xiàng)研究中，Stainier實(shí)驗(yàn)室采用同樣的技術(shù)路線也獲得了不同類(lèi)型的遺傳突變體，如：同框缺失突變；提前終止密碼子在最后一個(gè)外顯子上的突變體；啟動(dòng)子缺失突變體。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室針對(duì)不同基因遺傳突變體的分析結(jié)果同時(shí)顯示只有無(wú)義突變才能激活遺傳補(bǔ)償效應(yīng)。

此外，我們觀察到在補(bǔ)償基因和無(wú)義突變基因之間存在著核酸序列的同源性?；谶@些結(jié)果，我們提出了一個(gè)假設(shè)即無(wú)義突變mRNA通過(guò)提高同源基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)補(bǔ)償效應(yīng)。如果這個(gè)假設(shè)是正確的，那么具有這些特點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因也能激活內(nèi)源基因的表達(dá)。于是我們?cè)O(shè)計(jì)了不同的轉(zhuǎn)基因載體，利用這些載體構(gòu)建了一系列轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)。結(jié)果顯示，只有同時(shí)攜帶提前終止密碼子(無(wú)義突變)和核酸同源序列的轉(zhuǎn)基因載體才能誘導(dǎo)提高內(nèi)源同源基因的表達(dá)。Stainier實(shí)驗(yàn)室通過(guò)轉(zhuǎn)錄本測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在分別敲除、和等基因的小鼠細(xì)胞系中也會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)同源基因上調(diào)的現(xiàn)象；在斑馬魚(yú)中，他們采用體外注射的方法，證明只有注射與內(nèi)源基因同源無(wú)帽結(jié)構(gòu)的RNA才可以激活相應(yīng)內(nèi)源基因的上調(diào)。斑馬魚(yú)和小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示無(wú)義突變與核酸序列同源性是激活遺傳補(bǔ)償效應(yīng)的兩個(gè)必要條件。

4 無(wú)義mRNA降解途徑參與遺傳補(bǔ)償效應(yīng)

既然只有無(wú)義突變才能誘導(dǎo)遺傳補(bǔ)償效應(yīng)，NMD降解途徑是目前已知的細(xì)胞內(nèi)監(jiān)控?zé)o義突變的唯一機(jī)制，那么NMD是否參與遺傳補(bǔ)償效應(yīng)呢？我們?cè)谕蛔凅w中通過(guò)基因特異反義寡聚嗎啉代核苷酸來(lái)分別敲低NMD降解途徑中幾個(gè)關(guān)鍵因子、、和，分析敲低這些基因?qū)ρa(bǔ)償基因表達(dá)的影響。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些基因在遺傳補(bǔ)償效應(yīng)中作用，我們利用CRISPR/Cas9方法構(gòu)建、和突變體；在此基礎(chǔ)上，與突變體雜交，獲得各個(gè)基因與雙敲除突變體。非常有意思的是，我們發(fā)現(xiàn)遺傳補(bǔ)償效應(yīng)不需要參與無(wú)義突變mRNA降解的因子，如、和；相反，無(wú)論是敲低還是敲除功能尚未闡明的因子，都會(huì)阻止突變體中的遺傳補(bǔ)償效應(yīng)，使其出現(xiàn)小肝臟的表型；同時(shí)，我們還利用另一個(gè)具有遺傳補(bǔ)償效應(yīng)的基因突變體來(lái)驗(yàn)證這些NMD途徑中的關(guān)鍵因子在遺傳補(bǔ)償效應(yīng)中的作用，獲得類(lèi)似實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)充分證明，是參與遺傳補(bǔ)償效應(yīng)的關(guān)鍵因子。但是與我們研究結(jié)果不同的是，Stainier實(shí)驗(yàn)室在、和等基因突變體的基礎(chǔ)上敲除，發(fā)現(xiàn)遺傳補(bǔ)償效應(yīng)降低，于是他們提出無(wú)義mRNA的降解過(guò)程參與了遺傳補(bǔ)償效應(yīng)。綜合兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果可以得出這樣結(jié)論：NMD途徑參與了遺傳補(bǔ)償效應(yīng)的激活。

5 遺傳補(bǔ)償效應(yīng)與組蛋白修飾

綜合上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，接下來(lái)我們通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)證明無(wú)義突變mRNA與以前想象的并不一樣，一無(wú)用處，無(wú)義突變mRNA的轉(zhuǎn)錄翻譯，以及它的完整性對(duì)于“遺傳補(bǔ)償效應(yīng)”都是必需的。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果讓我們聯(lián)想到無(wú)義突變mRNA可能與一些長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)有類(lèi)似的功能，即與COMPASS (complex of proteins associated with Set1)復(fù)合體結(jié)合促進(jìn)一些基因的表達(dá)。COMPASS復(fù)合體主要負(fù)責(zé)組蛋白3上第4位賴氨酸的三甲基化修飾(histone H3 lysine 4 trimethylation, H3K4me3)，改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)基因的表達(dá)[14~16]。為了證實(shí)這一聯(lián)想，我們采用染色體免疫共沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)檢測(cè)在補(bǔ)償效應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域H3K4me3修飾的程度，發(fā)現(xiàn)在突變體中，H3K4me3修飾顯著增加；并且，敲低會(huì)降低突變體中補(bǔ)償效應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域H3K4me3的修飾。最后，我們通過(guò)蛋白互作實(shí)驗(yàn)證明Upf3a可以直接與COMPASS復(fù)合體中類(lèi)似于支架蛋白Wdr5結(jié)合；并且敲低或敲除，突變體的遺傳補(bǔ)償效應(yīng)被阻斷。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分顯示補(bǔ)償效應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域H3K4me3修飾在遺傳補(bǔ)償效應(yīng)中起著重要的作用。

Stainier實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)在敲除基因的小鼠細(xì)胞系中，補(bǔ)償效應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域H3K4me3修飾顯著增加，敲低會(huì)削弱遺傳補(bǔ)償效應(yīng)；同時(shí)，敲低也會(huì)降低相應(yīng)補(bǔ)償基因啟動(dòng)子區(qū)域的H3K4me3修飾。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)證實(shí)遺傳補(bǔ)償效應(yīng)與染色質(zhì)的表觀遺傳學(xué)修飾密不可分。

6 結(jié)語(yǔ)與展望

根據(jù)以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果，我們提出了“遺傳補(bǔ)償效應(yīng)”的分子機(jī)制模型：轉(zhuǎn)錄后無(wú)義突變mRNA可以與Upf3b結(jié)合，在細(xì)胞質(zhì)中通過(guò)NMD途徑降解；同時(shí)，未降解的無(wú)義mRNA或降解后的片段都可以與Upf3a結(jié)合，在Upf3a蛋白的幫助下，這些RNA重新進(jìn)入細(xì)胞核；Upf3a招募COMPASS復(fù)合體，在無(wú)義突變mRNA的幫助下，靶向與無(wú)義mRNA具有核酸序列同源性的基因附近，COMPASS復(fù)合體通過(guò)改變基因啟動(dòng)子區(qū)域表觀遺傳學(xué)修飾改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象，促進(jìn)同源基因表達(dá)，彌補(bǔ)缺失基因的功能，完成補(bǔ)償效應(yīng)(圖1)。

“遺傳補(bǔ)償效應(yīng)”并不是斑馬魚(yú)所獨(dú)有的現(xiàn)象，在其他模式生物中同樣存在，如小鼠、擬南芥[17,18]。來(lái)自于不同實(shí)驗(yàn)室的人類(lèi)基因組測(cè)序結(jié)果顯示，在正常人群的基因組中存在著大量攜帶有純合無(wú)義突變的基因，其中有些基因的錯(cuò)義突變會(huì)引起嚴(yán)重的人類(lèi)遺傳疾病[19,20]。我們推測(cè)“遺傳補(bǔ)償效應(yīng)”是產(chǎn)生這一現(xiàn)象的重要原因。該研究發(fā)現(xiàn)不僅僅在理論上取得了大的突破，而且還有實(shí)踐價(jià)值。例如，“遺傳補(bǔ)償效應(yīng)”對(duì)機(jī)體存活具有重要意義，但對(duì)于基因功能研究是一個(gè)巨大的障礙。斑馬魚(yú)超過(guò)80%的基因被敲除后沒(méi)有表型[21]，所以很難研究這些基因的功能，這其中大部分是由于“遺傳補(bǔ)償效應(yīng)”導(dǎo)致。針對(duì)這一問(wèn)題，目前就可以根據(jù)這兩項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)的機(jī)理，用不同方法阻斷“遺傳補(bǔ)償效應(yīng)”即可。比如，開(kāi)展基因敲低實(shí)驗(yàn)或直接在相應(yīng)的突變體中敲低/除Upf3a；同時(shí)在構(gòu)建突變體時(shí)，盡量避免構(gòu)建導(dǎo)致無(wú)義突變的突變體，如敲除基因啟動(dòng)子，以減少基因補(bǔ)償效應(yīng)的發(fā)生。

圖1 無(wú)義mRNA介導(dǎo)的遺傳補(bǔ)償效應(yīng)機(jī)制

NMD：無(wú)義mRNA介導(dǎo)的降解途徑；GCR：遺傳補(bǔ)償效應(yīng)；Upf3a：上游移碼蛋白3a；COMPASS：與Set1蛋白結(jié)合的蛋白復(fù)合體；H3K4me3：組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化修飾。

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Nonsense mutations and genetic compensation response

Zhipeng Ma, Jun Chen

The genetic compensation response (GCR) was firstly described in zebrafish to explain the phenotypic discrepancies between gene-knockout and gene–knockdown, whereby a deleterious mutation, but not gene-knockdown, can lead to the transcriptional upregulation of related genes, which can assume the function of the mutated gene. This phenomenon was also found in other model systems including mice and.However, the underlying molecular mechanism of the GCR remains elusive until two papers were published inon April 3, 2019: one from our lab and the other from Stainier’s lab. Using different genetic mutants of various genes in zebrafish or culture cells of mice, both of us reveal that the upregulation of compensatory genes is only triggered by mutations that generate a premature termination codon (PTC); the compensatory genes share nucleotide sequence homology to the mutated genes; nonsense mRNA mediated decay pathway (NMD) is essential for the induction of GCR, and the increased transcription of the compensatory genes is accompanied by an enhancement of H3K4 trimethylation (H3K4me3) at their transcription start site (TSS) regions.In this review, we summarize the mechanisms of the GCR proposed in the two studies.

genetic compensation response (GCR); nonsense mRNA mediated decay pathway (NMD); histone modification

2019-04-11;

2019-04-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31571511，31871500)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos: 31571511, 31871500)]

馬志鵬，在站博士后，研究方向：發(fā)育生物學(xué)。E-mail: singapore1987@163.com

陳軍，博士，教授，研究方向：發(fā)育生物學(xué)。E-mail: chenjun2009@zju.edu.cn

10.16288/j.yczz.19-101

2019/4/23 17:05:01

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190423.1704.001.html

(責(zé)任編委: 張博)