王 吉，衛(wèi) 禮，付 瑞，李曉波，王淑菁，鞏薇，岳秉飛，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院 國家實驗動物微生物遺傳檢測中心，北京 100050)

貓皰疹病毒I型(feline herpesvirus 1，F(xiàn)HV-1)又叫貓鼻氣管炎病毒(feline rhinotracheitis virus),屬皰疹病毒科，是有囊膜的雙鏈DNA病毒。病毒直徑約為128 nm～168 nm，能在貓胚腎、肺以及睪丸細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)良好增值和傳代。該病毒能致發(fā)貓鼻氣管炎病，貓是本病唯一的自然宿主，病貓是主要傳染源，通過直接接觸傳播[1-2]。主要侵害仔貓，感染貓癥狀嚴(yán)重時，出現(xiàn)體溫升高，明顯的上呼吸道感染[1-4].貓鼻氣管炎發(fā)病率可達(dá)100%，死亡率可達(dá)50%。病毒在病貓的鼻、咽喉、氣管和支氣管以及舌、結(jié)膜等的部位增殖。該病最早從美國發(fā)現(xiàn)，隨后在拿大、英國、荷蘭、瑞士、匈牙利、越南等地發(fā)現(xiàn)和流行，我國已多次發(fā)現(xiàn)可疑病例，并分離到病毒[3-6]。

貓作為實驗動物在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等研究領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，在某些試驗中，如降壓實驗、作為弱視動物模型及高眼壓動物模型等具有不可替代的作用[7-9]，目前在實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)及地方標(biāo)準(zhǔn)中，均沒有對實驗用貓的檢測要求及相關(guān)規(guī)定[10]。

本實驗旨在建立特異、敏感、快速、定量準(zhǔn)確的FHV-1實時熒光定量PCR檢測方法，通過分子生物學(xué)手段，開展對貓攜帶FHV-1核酸的檢測。對今后開展實驗用貓的檢測工作及實驗貓標(biāo)準(zhǔn)化研究具有積極的促進作用，同時通過對貓皰疹病毒攜帶情況的檢測，為貓質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒及樣品

貓皰疹病毒I型(FHV-1)、貓細(xì)小病毒 (又稱貓泛白細(xì)胞減少癥)(feline panleukopenia virus, FPV)：購自美國ATCC公司，編號分別為(VR-636、VR-652)；單純皰疹病毒I型(herpes simplex virus 1，HSV-1)、犬皰疹病毒(canine herpesvirus ,CHV)、豬偽狂犬病毒(porcine pseudorabies virus，PRV)：由中國食品藥品檢定研究院 實驗動物質(zhì)量檢測室提供；pGEM-T Easy-pol質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品：委托寶生物工程(大連)有限公司合成；pGEM T Easy質(zhì)粒(Promega公司)：寶生物工程(大連)有限公司；33只貓的48份樣品(眼分泌物、鼻分泌物、眼和鼻分泌物)來源于國內(nèi)7個單位。

1.2 主要試劑

DNA快速提取試劑盒購自德國Qiagen公司；Taq HS酶、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)、10× PCR buffer、100 bp DNA marker均購自寶生物工程(大連)有限公司；pGEM-T Easy-pol質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品：委托寶生物工程(大連)有限公司合成；pGEM T Easy質(zhì)粒(Promega公司)：寶生物工程(大連)有限公司；10× Q-PCR MIX：美國ABI公司。PCR儀：美國Bio-Rad公司MyCycler；核酸瓊脂糖凝膠電泳儀：美國Bio-Rad公司PwerPac Basic；凝膠成像分析儀：美國 Kodak公司 GL212Pro；熒光定量PCR儀：美國ABI公司7500 Fast Real-Time PCR System.。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)控品的制備

設(shè)計1對擴增TK基因保守區(qū)域的引物：P-1F：ATACTGTCCGCATTTACATAGA；P-1R：CGGTTCTTGAGCGTCCC。擴增片段長531 bp (66442～66972 nt)。該片段包含了探針及其引物所要擴增和檢測的片段。將該產(chǎn)物純化后連接到pGEM-T Easy載體，并進行克隆。陽性克隆通過測序進行鑒定。培養(yǎng)陽性克隆菌并提取質(zhì)粒，用核酸蛋白分析儀測定A260nm和A280nm，并計算提取的質(zhì)粒含量，質(zhì)粒置-20℃保存?zhèn)溆肹11,12]。

1.4 TaqMan探針及引物的設(shè)計

將不同株FHV-1病毒序列進行比對，選擇TK基因(序列號：FJ478159)保守區(qū)域[6、11]，采用ABI PrimerExpress 3.0實時熒光定量PCR引物設(shè)計軟件，設(shè)計合成TaqMan探針及引物。探針的熒光標(biāo)記選擇FAM(5’端)作為報告發(fā)光基團, NFQ(3’端)為淬滅基團，探針和引物由美國ABI公司合成。序列如下(表1)：

表1 用于擴增TK基因的引物與TaqMan探針序列

1.5 實時熒光定量PCR擴增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過優(yōu)化在熒光定量PCR反應(yīng)體系中使用的探針、引物、10× Q-PCR MIX濃度，確定最佳反應(yīng)體系為10× Q-PCR MIX 10 μL，探針+引物1 μL， DNA 1 μL，補水至20 μL。確定最佳反應(yīng)條件為：50℃保持2 min；然后95℃預(yù)變性10 min；最后95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個循環(huán)，在每個循環(huán)的延伸結(jié)束時進行熒光信號檢測。在96孔板中按以下體系加樣，每個樣品做三個重復(fù)。

用含有目的片段的質(zhì)粒pGEM-T Easy-pol作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)公式copies/μL=(6.02 × 1023)×(ng/μL × 10-9)/(DNA length × 660)，算出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)。將其稀釋為109copies～100copies，作為模板進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[12,13]。

Query:測序結(jié)果；sbjct:FHV-1文獻序列

1.6 實時熒光定量PCR檢測方法的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測

設(shè)定FHV-1、FPV、HSV-1、CHV、PRV及CRFK陰性對照，檢測FHV-1實時熒光定量PCR檢測方法的特異性；用實時熒光定量PCR檢測方法對105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL 3個不同濃度陽性標(biāo)準(zhǔn)品，分3個不同時間重復(fù)檢測3次，計算批間變異系數(shù)，評價本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.7 實時熒光定量PCR檢測方法靈敏性檢測

取109～100copies標(biāo)準(zhǔn)品，進行實時熒光定量PCR 檢測，每個濃度標(biāo)準(zhǔn)品各做3個復(fù)孔。所能檢測的最小濃度梯度的循環(huán)閾值(CT)≥35,拷貝數(shù)(copies)≥10時,此濃度為方法的檢測靈敏度。

1.8 實時熒光定量PCR方法的應(yīng)用

實時熒光定量PCR檢測，48份樣品分2次檢測，第1次檢測b1～b15，第2次檢測y1～y15、yb56、yb64、yb65、x16、x18、x19、x24、x28、x29、x38、x40、x41、x44、x46、x47、x56、x57、x63。每次設(shè)107～103copies標(biāo)準(zhǔn)品和CRFK細(xì)胞陰性對照。標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照及樣品均做3個重復(fù)。

判斷標(biāo)準(zhǔn)的制定：建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)Slope在-3～-3.5之間、R2大于0.99、Eff%在90%-110%之間，實驗成立可用于定量檢測。

樣品循環(huán)閾值(CT)≥35,同時拷貝數(shù)(copies)≥10,判定該樣品檢測結(jié)果為陽性；循環(huán)閾值(CT)≥35、拷貝數(shù)(copies)<10，或者循環(huán)閾值(CT) <35、拷貝數(shù)(copies)≥10，或者循環(huán)閾值(CT) <35、拷貝數(shù)(Copies)<10，此樣品超出檢測限，不能確定被檢樣品是陽性樣品，結(jié)果判為陰性[12,13]。

2 實驗結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)控品的制備

陽性克隆經(jīng)測序進行鑒定，測序結(jié)果與GenBank中FHV-1標(biāo)準(zhǔn)株核苷酸序列進行比對，其同源性均為100%，見圖1。說明成功制備了陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，可作為熒光定量PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)對照品。

經(jīng)拷貝數(shù)計算公式copies/μL=(6.02 × 1023)×(ng/μL × 10-9)/(DNA length × 660)計算，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品原濃度為2.55× 1011copies/μL。

2.2 實時熒光定量PCR擴增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對引物及探針濃度進行優(yōu)化后，得到FHV-1擴增曲線結(jié)果如圖2。FHV-1的循環(huán)閾值CT值為14.023，拷貝數(shù)為2.597×107copies/μL。

用含有目的片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，分別設(shè)為1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102copies/μL，作為模板進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，擴增曲線如圖3。擴增曲線各稀釋梯度間距均勻，線性范圍1個log(1×102～1×109拷貝)，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)Slope為3.23(在-3～-3.5之間)，R2值為0.997(>0.99)說明相關(guān)性高，定量結(jié)果有效，擴增效率Eff為103.418%(90%～110%之間)。標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣本三個重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差(CTSD值)均小于0.232，說明定量結(jié)果精密度高，具有很好的重復(fù)性。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)遠(yuǎn)優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定范圍，可用于定量檢測。

圖2 FHV-1Q-PCR擴增曲線

圖3 109～102 copies標(biāo)準(zhǔn)品擴增曲線

2.3 實時熒光定量PCR檢測方法的特異性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性檢測結(jié)果

2.3.1 實時熒光定量PCR檢測方法特異性檢測：分別以FHV-1、FPV、HSV-1、CHV、PRV及CRFK細(xì)胞為模板進行檢測，結(jié)果如圖4所示，可以看出以FPV、HSV-1、CHV、PRV為模板，擴增曲線均為直線無擴增，陰性對照CRFK細(xì)胞也為直線無擴增，而以FHV-1為模板擴增曲線明顯。說明建立的熒光定量PCR檢測方法具有良好的特異性。

2.3.2 實時熒光定量PCR方法重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測結(jié)果：起始濃度分別為1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品的最終實測值的均值分別為0.991×103、1.060×104、1.005×105copies/μL，對應(yīng)CTSD值及CV值分別為見表2。3個濃度梯度3次重復(fù)實驗Ct值的變異系數(shù)(CV)均小于5%，表明方法重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。

1：FHV-1；2-6： FPV、HSV-1、CHV、PRV、CRFK

圖5 109～100 copies標(biāo)準(zhǔn)品的擴增曲線

表2熒光定量PCR檢測方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗結(jié)果

Tab.2The results of repeatability and stability test of the Q-PCR

標(biāo)準(zhǔn)品(copies/μL)standard(copies/μL)實驗次數(shù)The number of experiment每次檢測CT均值Mean CT value of every time detection 3次檢測CT均值Mean CT value of three times detection標(biāo)準(zhǔn)差CTSD變異系數(shù)CV (%)Coefficient of variation (%)118.694105217.26418.0520.7264.0318.197122.354104221.72622.2910.5362.4322.793125.957103225.02125.8760.8173.2326.649

圖6 109～100 copies標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 熒光定量PCR檢測方法靈敏度檢測

如圖5、圖6可知，擴增曲線各稀釋梯度間距均勻，線性范圍 (1×100～1×109copies/μL)，良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率Slope為-3.156、相關(guān)系數(shù)R2值為0.993(>0.99)，擴增效率Eff%為107.052%(90%-110%之間)。標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到1.0×101copies/μL時有明顯擴增曲線，CT值為31.856，拷貝數(shù)為10.23 copies，仍在可信范圍之內(nèi)； 1.0×100copies/μL時有擴增曲線，CT值為34.705，拷貝數(shù)為1.121 copies，已超出可信范圍。所以臨界稀釋度為1.0×101時，其對應(yīng)的拷貝數(shù)為10，因此最低檢測限度為10個拷貝/μL。說明建立的熒光定量PCR方法有很高的靈敏度。

圖7 1～15號貓鼻分泌物(b1～b15)擴增曲線

2.5 實時熒光定量PCR方法的應(yīng)用

將所建立的實時熒光定量PCR方法用于33只貓的48份樣品檢測，得到擴增曲線如圖3-7為b1～b15擴增曲線；圖8為y1～y15擴增曲線；圖9為yb56、yb64、yb65、x16、x18、x19、x24、x28、x29、x38、x40、x41、x44、x46、x47、x56、x57、x63擴增曲線。2次檢測標(biāo)準(zhǔn)品擴增曲線分別為 圖10、圖11，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)Slope分別為3.19、3.27(均在-3～-3.5之間)，R2值分別為0.996、0.994(均>0.99)，擴增效率Eff分別為105.127%、101.639(均在90%-110%之間)。

經(jīng)過熒光定量PCR檢測b3、b4、b5、b6、b7、b8、b11～b15，y4、y5、y6、y7、y11～y15，yb56、yb64、yb65、x16、x19、x24、x28、x38、x41、x47、x56、x57、x63的循環(huán)域值(Ct值均≥35)和拷貝數(shù)(copies均≥10)均在檢測限之內(nèi)，所以判定上述樣品為熒光定量檢測陽性。其他15份樣品或循環(huán)域值(CT)超出檢測限，或擴增拷貝數(shù)小于檢測限，或同時在檢測限之外，所以均判為陰性(樣品檢測結(jié)果見表3)。48份樣品檢測結(jié)果陽性率為(33/48)68.75%，33只貓經(jīng)檢測FHV-1陽性率為(23/33)69.70%。

圖8 1～15號貓眼分泌物(y1～y15)擴增曲線

圖9 3只貓眼鼻分泌物和15份血清擴增曲線

圖10 第一次檢測的標(biāo)準(zhǔn)品擴增曲線

圖11 第二次檢測的標(biāo)準(zhǔn)品擴增曲線

3 討論

貓可較好的耐受麻醉和一般手術(shù)，手術(shù)時能保持正常血壓。在藥品的降壓物質(zhì)檢查中，貓作為中國藥典規(guī)定的實驗動物[10，15]，越來越多的被用于形覺波剝奪性弱視、食管病等研究[16，17]。貓作為實驗動物，雖然應(yīng)用越來越廣泛[18-20]，但國內(nèi)目前尚未見有開展貓的檢測。雖然早在1999年，蔣虹等[21]就建立過貓鼻氣管炎病毒血清學(xué)檢測方法，2011年前劉寶山、林穎、屈哲[22-24]先后建立了FHV-1 PCR檢測方法，但都沒有推廣開來，實驗用貓到目前為止也沒有標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)定。目前，實驗用貓也多是從商販或收購型飼養(yǎng)場購買，其來源混雜，遺傳、年齡、微生物和寄生蟲等攜帶情況不清，實驗重現(xiàn)性差，結(jié)果隱存著未知因素的影響[15]。FHV-1是目前已知最重要的貓呼吸道疾病之一，其發(fā)病率和死亡率均較高,嚴(yán)重危害貓的健康。目前國內(nèi)還沒有開展貓皰疹病毒等貓易感病毒臨床檢測的機構(gòu)，仍未見有開展實驗用貓FHV-1檢測的報道，國內(nèi)也沒有相關(guān)檢測試劑盒的出售。

近年來，實時熒光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR) 技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強等優(yōu)點在基因表達(dá)水平分析、突變和多態(tài)性研究、病原體的定性和定量檢測等方面得到廣泛應(yīng)用[12-14]。該方法提供了用于對FHV-1進行實時熒光定量PCR檢測的引物和TaqMan探針，以實現(xiàn)貓FHV-1核酸的定量檢測，提高檢測的特異性和準(zhǔn)確性。

表3 熒光定量PCR方法檢測48份樣品結(jié)果

實驗所建立的TaqMan探針實時熒光定量PCR方法，以重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，擴增曲線各稀釋梯度間距均勻，線性范圍8個log(102～109拷貝)定量范圍寬，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2值均為>0.99，說明相關(guān)性高定量結(jié)果準(zhǔn)確。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)(Slope均在-3～-3.5之間、R2均大于099、Eff%均在90%～110%之間)均在規(guī)定范圍之內(nèi)，優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)特異性檢測與貓細(xì)小病毒、單純皰疹病毒1型、犬皰疹病毒及豬偽狂犬病毒均無交叉反應(yīng)，證明方法特異性良好。經(jīng)靈敏度檢測，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到101時仍有擴增曲線，最低可檢測到10拷貝/μL。對起始濃度分別為1×103、1×104、1×105拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品進行重復(fù)測定， CT值變異系數(shù)均小于5%。說明此方法具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性[12-14]。

用熒光定量PCR技術(shù)檢測FHV-1,目前在國內(nèi)尚未有報道。本研究對引物和探針的濃度及反應(yīng)條件進行優(yōu)化，建立了特異、敏感的FHV-1快速定量檢測方法。對貓的檢測結(jié)果顯示，該方法檢測的33只貓，陽性率為69.70%(23/33)，明顯高于本室建立的常規(guī)PCR(陽性率63.64(21/33))檢出率。但從檢測成本考慮，熒光定量PCR檢測成本稍高于常規(guī)PCR。實驗建立的FHV-1熒光定量PCR方法為進一步研究FHV-1在貓群中的流行情況及對貓的感染機制及其致病機制奠定了基礎(chǔ)。為實驗用貓的質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了科學(xué)參考依據(jù)。

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